[发明专利]一种猪NF-κappaBC-Rel亚基真核表达载体的构建

摘要

本发明提出了一种猪NF-κappaBC-Rel亚基的真核表达载体的构建，其构建方法为：首先，根据C-Rel基因，设计了一对特异性引物P1、P2，用重组PCR的方法扩增出目的基因，使其两段分别带上EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点，把目的片段和载体双酶切后用SolutionI进行连接反应，再把重组质粒转化入DH5a大肠杆菌，建立PMD19-T-C-Rel重组质粒。其次，把重组质粒和pcDNA3.1(+)载体双酶切后用SolutionI进行连接反应，再把重组质粒转化入DH5a大肠杆菌最后，分别采用了PCR法，双酶切法和测序法三种方法进行筛选和鉴定阳性菌落。测序结果显示重组质粒序列与GenBank中的目的片段序列一致。证明目的基因已经插入pcDNA3.1(+)载体，重组质粒构建成功。

主权项

一种猪NF‑κappaBC‑Rel亚基的真核表达载体的构建，其特征在于，所述载体为pcDNA3.1‑C‑Rel重组载体，该重组载体是通过以下方法构建获得的：步骤一、PMD19‑T‑C‑Rel重组质粒的构建：采集猪前腔静脉血，分离出淋巴细胞获得cDNA，再用引物P1、P2扩增出C‑Rel目的片段，构建PMD19‑T‑C‑Rel重组质粒；步骤二、C‑Rel基因转录片段的获得：以PMD19‑T‑C‑Rel重组质粒为模板，进行EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切，将酶切的目的片段用胶回收试剂盒回收，用于连接反应；步骤三、pcDNA3.1(+)质粒的酶切：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，进行EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切，酶切产物经1%的琼脂凝胶电泳后，胶回收试剂盒进行大片段回收，‑20℃保存备用；步骤四、连接反应：C‑Rel基因片段和pcDNA3.1(+)载体片段按3：1摩尔比例，在连接酶的作用下，置于4℃反应过夜；步骤五、将连接产物转化入DH5a感受态细胞，即：取连接产物10ul加入200ulDH5a感受态细胞，冰浴30min，42℃90s，再冰浴5min，加入1mlLB液体培养基，37℃震荡培养60min，取200ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12‑18h；步骤六、挑选单个疑似菌落用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，将初步鉴定阳性的pcDNA3.1‑C‑Rel重组质粒进行测序，比较重组质粒序列与GenBank中的目的片段序列的一致性。