[发明专利]一种猪NF-κappaBC-Rel亚基真核表达载体的构建

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体的构建，特别是涉及一种猪NF-κappaBC-Rel亚基真核表达载体的构建。

背景技术

细胞核转录因子-κB（Nucleartranscriptionfactor-κappaB，NF-κB）是一类能结合多种基因启动子区的固定核苷酸序列并启动基因转录功能的蛋白，通过调节细胞因子，趋化、生长因子，黏附分子及多种酶的基因表达，参与机体免疫调节和炎症反应，它是细胞核内重要的转录调节因子，是细胞存活、细胞周期、细胞黏附和迁移的重要调节者。NF-κB是由NF-κB/Rel蛋白家族的5个成员，包括NF-κB1(P50/P105)、NF-κB2(P52/P100)、RelA(P65)、RelB和C-Rel以同源或异源二聚体形式组成的，即为不同的转录因子，发挥不同的转录激活特性。其中P50和P65亚基在细胞中广泛存在，RelB仅在胸腺和淋巴结中表达，而C-Re1只在造血细胞和淋巴细胞中表达；目前已知的异源二聚体有p50/P65，p50/C-Rel，P65/C-Rel，其中最常见的是由P50与P65形成的P50/P65异源二聚体。在静息状态时，NF-κB通常与其抑制物IκB结合形成无活性的三聚体形式存在于细胞浆，当细胞受到细胞外信号刺激时，通过一个或多个信号转导途径，NF-κB与IκB解离，迅速发生核易位，形成有活性的NF-κB，发挥其功能。在P50/P65活化的过程中，P50亚基用于与κB序列结合，而P65亚基有两个重要功能，即利用其C端的反式激活域增强靶基因的转录激活及与各种IκB成员直接耦联。

近年来，NF-κB被作为作用靶点治疗或缓解多种人类自身免疫系统性疾病的一大研究热点，因此构建一种NF-κBC-Rel亚基的真核表达载体，以期为进一步C-Rel在多种免疫抑制性疾病感染机制中的作用的研究奠定基础就显得尤为重要。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种猪NF-κappaBC-Rel亚基的真核表达载体的构建，为研究C-Rel基因在多种免疫抑制性疾病感染机制中的作用提供一个有效的工具。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种猪NF-κappaBC-Rel亚基的真核表达载体的构建，所述载体为pcDNA3.1-C-Rel重组载体，该重组载体是通过以下方法构建获得的：

步骤一、PMD19-T-C-Rel重组质粒的构建：采集猪前腔静脉血，分离出淋巴细胞获得cDNA，再用引物P1、P2扩增出C-Rel目的片段，构建PMD19-T-C-Rel重组质粒；

步骤二、C-Rel基因转录片段的获得：以PMD19-T-C-Rel重组质粒为模板，进行EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切，将酶切的目的片段用胶回收试剂盒回收，用于连接反应；

步骤三、pcDNA3.1(+)质粒的酶切：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，进行EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切，酶切产物经1%的琼脂凝胶电泳后，胶回收试剂盒进行大片段回收，-20℃保存备用；

步骤四、连接反应：C-Rel基因片段和pcDNA3.1(+)载体片段按3：1摩尔比例，在连接酶的作用下，置于4℃反应过夜；

步骤五、将连接产物转化入DH5a感受态细胞，即：取连接产物10ul加入200ulDH5a感受态细胞，冰浴30min，42℃90s，再冰浴5min，加入1mlLB液体培养基，37℃震荡培养60min，取200ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12-18h；

步骤六、挑选单个疑似菌落用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，将初步鉴定阳性的pcDNA3.1-C-Rel重组质粒进行测序，比较重组质粒序列与GenBank中的目的片段序列的一致性。

进一步的，上述载体构建步骤一中，针对C-Rel基因的特异性引物为：

P1：

5’-GAATTCGCCACCATGGGACACTATTCACAACGTGGGTATAAC-3’；

P2：

5’-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAAACTCAAATGCAA-3’。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供一种猪NF-κappaBC-Rel亚基的真核表达载体，为研究C-Rel基因在多种免疫抑制性疾病感染机制中的作用提供一个有效的工具。

附图说明

图1为PCR鉴定C-Rel基因真核表达目的产物的琼脂糖凝胶电泳图。