[发明专利]基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法

摘要

基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，包括对H1N1病毒血凝素基因进行RT-PCR扩增；对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。通过将检验结果与甲型H1N1流感病毒标准株的HA基因裂解位点序列比较，可高度准确的检测出甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位点的突变。本发明对于确定病毒毒力、致病性及宿主范围提供了简单、快捷的实验方案,避开了全基因测序所涉及的繁琐实验步骤，还能准确掌握病毒的变异方向,方便对其进行监测，隔离传染源切断传播途径，阻止疫情的进一步扩大。

主权项

基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，其特征在于包括以下步骤：1.对H1N1病毒血凝素(HA)基因进行RT‑PCR扩增；1.1用具有H1F所示序列的PCR引物和具有和H1R所示序列的PCR引物，对H1N1病毒血凝素(HA)基因进行第一轮扩增，以提取的病毒RNA为模板；RT‑PCR反应条件为:50℃反转录30min;94℃预变性2min;94℃15s,55℃30s,68℃1min,45个循环;68℃5min；第一轮扩增PCR引物序列如下：H1F:ACGTGTTACCCAGGAGATTTCH1R:TCTTTACCYACTRCTGTGAA1.2用带有生物素（Biotin）标记的Reverse PCR引物和Forward PCR引物进行第二轮扩增，模板为第一轮扩增的PCR产物；PCR反应过程如下：先在94℃下进行预热10分钟；在94℃下保持45秒进行变性、64℃下保持45秒进行退火、72℃下保持90秒进行扩增和延伸，循环退火过程30次；最后在72℃下保持10分钟。第二轮扩增PCR引物Reverse引物5`‑GGTTCCCAC GATATTTGTGGT‑3Forward引物5′‑AAAAGGTCCACC AACTTGAGAAAT‑3‑2.对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT，具体如下：（1）将第二轮PCR扩增产物固定在磁珠上，（2）将磁珠吸附在真空样品转移器上，再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5～10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA，（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入序列测序引物，测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L，再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交；测序引物的序列：5‑GTTACTTTGGC CGTT‑3（4）焦磷酸测序：利用测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息，（5）将焦磷酸测序检验结果与甲型H1N1流感病毒标准株的HA1基因裂解位点序列相比较，进而判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变。