[发明专利]基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，具体涉及一种基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，属于病毒检测技术领域。 

背景技术

2009年3月爆发的甲型H1N1流感是继SARS、高致病性禽流感后又一次重大公共卫生事件,给世界各国人民造成了巨大恐慌。甲型流感病毒是单股负链分节段的RNA病毒，易发生抗原漂移、抗原转换和基因重组，尤其是病毒的外膜蛋白血凝素(HA)的突变和重组，可形成各种突变株或重组株，导致病毒的毒力及宿主范围的变化，从而引起不同程度的流感流行。血凝素（HA)能否被切割成HA1和HA2是决定流感病毒致病性的重要因素，裂解位点的变异可引起病毒致病性的变化，分析裂解位点的序列,研究其进化规律可以让我们更深入地了解H1N1的致病性、毒力大小、宿主范围. 

裂解位点处的氨基酸序列是决定流感病毒致病力的因素之一。一般高致病性流感病毒在裂解位点附近都有连续4个以上碱性氨基酸(RRRR)，而低致病性流感病毒的HA裂解位点处一般就只有单个的碱性氨基酸(R)。高致病性流感病毒的HA裂解位点处多个连续的碱性氨基酸,可以被多种蛋白酶所裂解,因而病毒可以在宿主不同组织细胞中生长繁殖,导致宿主的全身感染、衰竭并导致死亡。而低致病性流感病毒的HA蛋白裂解位点只能被呼吸道等少数组织细胞中的蛋白酶所裂解,因而只能在宿主的呼吸道中繁殖,导致温和感染。HA蛋白的裂解位点的序列特征对病毒的宿主范围、组织嗜性和致病性有着关键性影响,是病毒在机体中传播的必要条件]。低致病性流感病毒有可能通过HA1区和HA2区之间的连接肽中的多种碱性氨基酸的基因突变增强毒力,变成高致病性的病毒株，因此，HA的裂解位点序列分析和监测是非常重要 

为了加强对H1N1快速传播的控制及避免其爆发流行，发展快速、可靠高通量的检测病毒突变技术是研究的热点，传统的基于Sanger法的全自动DNA测序技术，在检测病毒基因突变存在费时、费力的缺点。焦磷酸测序技术为新一代短片段DNA序列分析技术，可以快速、准确、实时地进行短DNA序列分析，检测通量高，操作简单方便，可程序化，利用焦磷酸测序技术对甲型H1N1流感HA基因的裂解位点进行检测的研究未见报道。 

发明内容

本发明目的是提供一种基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，其使用焦磷酸测序方法检测甲型H1N1流感病毒血凝素（HA)裂解位点的序列方法，判断血凝素(HA)的裂解位点是否发生突变，导致病毒的毒力的变化，从而引起不同程度的流感流行。 

由于血凝素（HA)能否被切割成HA1和HA2是决定流感病毒致病性的重要因素，裂解位点的变异可引起病毒致病性的变化，因此本发明的技术构思是针对甲型H1N1流感病毒裂解位点进行焦磷酸测序检测。本发明的检测型H1N1流感病毒致病力变化的方法，首先采用RT-PCR扩增H1N1病毒血凝素(HA)基因中片段（包含裂解位点序列），随后以焦磷酸测序法对扩增片段进行准确测序，从而建立了一种快速、有效的裂解位点突变检测方法。对于确定病毒毒力、致病性及宿主范围提供了简单、快捷的实验方案，避开了全基因测序所涉及的繁琐实验 步骤，还能准确掌握病毒的变异方向,方便对其进行监测，隔离传染源切断传播途径，阻止疫情的进一步扩大。 

本发明的主要原理为: 

焦磷酸测序技术 

1)焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是全新的一种DNA序列分析技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。