[发明专利]一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法

摘要

本发明属核酸检测领域，涉及一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法；该方法基于鼠痘病毒血凝素基因的序列设计了特异性的引物和Taqman探针，用于快速、特异和高灵敏度地检测鼠痘病毒，本发明方法能稳定和有效地扩增鼠痘基因片段，最高检测灵敏度能达到10-1fg/μL；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；本发明方法检测鼠痘快速，灵敏，可靠。可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于鼠痘的流行病学的监测工作，有助于对噬齿类实验动物和野生动物中鼠痘感染疫情作出早期快速诊断。

主权项

一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：（1）标本采集取鼠患部皮肤渗出液、血液、腹水、及组织器官，其中，组织样品加等体积生理盐水制成匀浆，离心，收集上清液待检；血液和腹水直接用于检测；（2）设计引物和荧光探针收集Genbank库中收录的分离的鼠痘病毒血凝素基因编码序列，采用VectorNTI Suite软件分析其保守序列，用PrimerExpress软件设计引物和TaqManMGB探针；（3）DNA抽提采用QIAampDNABloodminikit（QIAGEN51106）提取病毒基因组DNA：取待检上清液或血清，加入蛋白酶K混匀,再加入裂解缓冲液AL，水浴中孵育，将溶液加入吸附柱中离心，顺序加入缓冲液AW1和AW2洗后用三蒸水洗脱DNA；（4）Real‑timePCR检测按如下配置反应体系：10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶0.25μL、模板1μL、上下游引物各0.25μL、TaqMan探针0.25μL，加水补足总体积至25μL；其中，反应条件为：首先95℃3min；然后95℃15s，58℃45s，运行40个循环，并在58℃进行荧光信号采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行；所述的上下游引物（TEVF、TEVR）和TaqMan探针（TEVP）序列为：（5）评估Real‑timePCR的特异性选取鼠痘病毒标准株感染的阳性临床样本及其它鼠病毒临床样本，采用QIAampDNABloodminikit（QIAGEN51106）提取上述病毒临床样本的基因组DNA，再以上述基因组DNA为模板进行real‑timePCR，观察扩增曲线；（6）评估Real‑timePCR的灵敏度将提取的鼠痘病毒DNA定量后制成标准品进行Standardcurve实验，其包括：首先微量紫外分光光度计（Thermo，NanoDropND‑2000C）对鼠痘病毒DNA进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制成不同浓度的标准品，再以所述标准品为模板进行Real‑time PCR，获得Standardcurve；（7）评估Real‑timePCR检测临床标本的可靠性对鼠痘病毒阳性临床样本及鼠痘病毒感染呈阴性的小鼠组织标本，进行DNA提取，然后采用Real‑timePCR法检测，验证荧光PCR方法的准确性和可靠性。