[发明专利]一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法

权利要求书

1.一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）标本采集

取鼠患部皮肤渗出液、血液、腹水、及组织器官，其中，组织样品加等体积生理盐水制成匀浆，离心，收集上清液待检；血液和腹水直接用于检测；

（2）设计引物和荧光探针

收集Genbank库中收录的分离的鼠痘病毒血凝素基因编码序列，采用VectorNTI Suite软件分析其保守序列，用PrimerExpress软件设计引物和TaqManMGB探针；

（3）DNA抽提

采用QIAampDNABloodminikit（QIAGEN51106）提取病毒基因组DNA：取待检上清液或血清，加入蛋白酶K混匀,再加入裂解缓冲液AL，水浴中孵育，将溶液加入吸附柱中离心，顺序加入缓冲液AW1和AW2洗后用三蒸水洗脱DNA；

（4）Real-timePCR检测

按如下配置反应体系：10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶0.25μL、模板1μL、上下游引物各0.25μL、TaqMan探针0.25μL，加水补足总体积至25μL；

其中，反应条件为：首先95℃3min；然后95℃15s，58℃45s，运行40个循环，并在58℃进行荧光信号采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行；

所述的上下游引物（TEVF、TEVR）和TaqMan探针（TEVP）序列为：

（5）评估Real-timePCR的特异性

选取鼠痘病毒标准株感染的阳性临床样本及其它鼠病毒临床样本，采用QIAampDNABloodminikit（QIAGEN51106）提取上述病毒临床样本的基因组DNA，再以上述基因组DNA为模板进行real-timePCR，观察扩增曲线；

（6）评估Real-timePCR的灵敏度

将提取的鼠痘病毒DNA定量后制成标准品进行Standardcurve实验，其包括：首先微量紫外分光光度计（Thermo，NanoDropND-2000C）对鼠痘病毒DNA进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制成不同浓度的标准品，再以所述标准品为模板进行Real-time PCR，获得Standardcurve；

（7）评估Real-timePCR检测临床标本的可靠性

对鼠痘病毒阳性临床样本及鼠痘病毒感染呈阴性的小鼠组织标本，进行DNA提取，然后采用Real-timePCR法检测，验证荧光PCR方法的准确性和可靠性。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中：所述的组织样品采用患鼠肝、脾、中枢神经、淋巴结、肺或小肠经加等体积生理盐水制成匀浆，3000g离心15min，收集上清液制成。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：收集的分离的鼠痘病毒血凝素基因编码序列为Genbank库中收录的不同国家和地区的。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中抽提DNA包括步骤：取200μL待检上清液或血清，加入20μL蛋白酶K混匀,再加入200μL裂解缓冲液AL，于56℃水浴中孵育10min，将溶液加入吸附柱中离心，加入缓冲液AW1洗1次，再加AW2洗1次，最后用50μl三蒸水洗脱DNA。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的引物和探针序列其位置是参考鼠痘病毒血凝素基因的保守序列（GenbankNo.AF375091）。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的实时荧光定量PCR仪为AppliedBiosystems,ViiA^TM7系统。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的其它鼠病毒临床样本选自：小鼠肝炎病毒（Mousehepatitisvirus，MHV）、小鼠肺炎病毒（Pneumoniavirus ofmice，MPV）、仙台病毒（Sendaivirus，SV）、呼肠孤病毒3型（Reovirustype3，Reo-3）或小鼠细小病毒（Parvovirusminutevirusofmice，MVM）。