[发明专利]野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法

摘要

本发明涉及野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法。采用的技术方案是：用定点突变技术构建cC的I108T突变体；利用pPICZαA载体构建糖基化cC的表达系统；糖基化cC在毕赤酵母中的表达；糖基化cC的分离纯化。本发明探究了糖基化cC的最适发酵条件的方法是：设计不同发酵条件，分别对I108T菌株进行25℃和30℃培养，诱导表达培养基YPM分别做pH4、pH5、pH7、添加0.1mM/LPMSF、添加1%酪蛋白水解物处理。本发明验证了糖基化cC对于淀粉样沉积具有明显抑制作用，N端糖基化可阻止cC形成淀粉样纤维而不影响其本身抑制活性，可以更好地用来研究淀粉样蛋白沉积疾病。

主权项

野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于步骤如下：1）用定点突变技术构建野生型cC的I108T突变体：通过PCR的方法获得在野生型cC的cDNA的两端添加XhoⅠ和XbaⅠ切割位点的序列；用定点突变技术对野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asn106‑Ile108突变为Asn106‑Thr108，得到野生型cC的I108T突变体； 2）利用pPICZαA载体构建重组质粒：利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZαA质粒载体，通过T₄ DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒；3）糖基化cC 在毕赤酵母中的表达：将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用AvrⅡ线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X‑33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基中活化，25 ℃或30 ℃，250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中25 ℃或30 ℃、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000× g 离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 ℃，250rpm 诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h 以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液；4）糖基化cC的分离纯化：诱导表达后的菌液，首先3000×g，4℃，离心10min，除去菌体留上清液，再11900×g，4℃，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScal TFF System浓缩；然后用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将浓缩液稀释到5倍体积后，样品通过CM‑Toyopearl 离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M‑0.5M的NaCl进行梯度洗脱，与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有糖基化的cC，再将收集的混合液经过夜透析除盐，得到糖基化的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。