[发明专利]野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法

权利要求书

1.野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于步骤如下：

1）用定点突变技术构建野生型cC的I108T突变体：通过PCR的方法获得在野生型cC的cDNA的两端添加XhoⅠ和XbaⅠ切割位点的序列；用定点突变技术对野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asn106-Ile108突变为Asn106-Thr108，得到野生型cC的I108T突变体； 

2）利用pPICZαA载体构建重组质粒：利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZαA质粒载体，通过T₄ DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒；

3）糖基化cC 在毕赤酵母中的表达：将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用AvrⅡ线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基中活化，25 ℃或30 ℃，250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中25 ℃或30 ℃、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000× g 离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 ℃，250rpm 诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h 以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液；

4）糖基化cC的分离纯化：诱导表达后的菌液，首先3000×g，4℃，离心10min，除去菌体留上清液，再11900×g，4℃，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScal TFF System浓缩；然后用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将浓缩液稀释到5倍体积后，样品通过CM-Toyopearl 离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M-0.5M的NaCl进行梯度洗脱，与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有糖基化的cC，再将收集的混合液经过夜透析除盐，得到糖基化的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

2.如权利要求1所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于：步骤3）中，所述的YPM诱导表达培养基的组成是：包括1%酵母浸粉和2%蛋白胨，初始pH为4-7。

3.如权利要求2所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于：所述的YPM诱导表达培养基中含有0.1mM/L PMSF或1%酪蛋白。

4.如权利要求3所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于：所述的YPM诱导表达培养基初始pH为7。

5.如权利要求4所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于：步骤3）中，将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用AvrⅡ线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基中活化，30 ℃，250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30 ℃、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000× g 离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 ℃，250rpm诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h 以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液。