[发明专利]野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法

说明书

技术领域

本发明涉及野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂（chicken cystetine， cC）的糖基化方法及表达糖基化cC最适发酵条件的探究，涉及基因工程、分子生物学、微生物学领域。

背景技术

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程，它是指蛋白质与葡萄糖(醛基糖)之间发生的非酶反应而生成糖化蛋白的过程，即指在肽链生物合成的同时或合成后在酶的催化下糖链被接到肽链上的特定糖基化位点的过程。糖基化是真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意义。

糖复合物中糖链的功能多种多样，如从空间上调节糖复合物的整体结构、保护多肽链不被蛋白酶水解、防止与抗体识别等。糖链的存在对肽链的折叠、糖蛋白质的进一步成熟、分拣、投送、以及最后的定位都有重要影响。糖蛋白的糖链能修饰并改变蛋白的内在特性，对糖蛋白整体生物学功能的体现至关重要。

鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin ，cC)是由116个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示， cC含有两个二硫键，分子量约为14kDa，是一种分泌性蛋白。由于与人cystatin C（人类血液、精液及唾液中含有大量的此抑制剂）相似，同属于cystatin超家族Ⅱ。因此常用cC来代替人cystatin C来研究淀粉样蛋白沉积疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病、疯牛病和亨廷顿病等。蛋白质沉积疾病很大一部分具有高度的致死性，它们共同的特征是蛋白质纤维化聚合物成为细胞内含物或细胞外的淀粉样物质。

生物体内存在某些因素控制着蛋白质的糖基化，包括：(1)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布和数目；(2)在糖蛋白的生物合成过程中，糖蛋白的折叠方式，即蛋白质的三维空间结构，影响糖基转移酶与蛋白表面特定序列的接触，从而引起糖链的延伸和添加糖基的不同；(3)合成糖蛋白细胞中糖基转移酶及相关酶类的表达类型；(4)细胞中不同糖链加工区域的排列，以及糖链通过这些区域的速率。前两点只影响糖基化的位点，后两点则可归结为表达系统中细胞的类型和培养条件等因素影响，从而决定糖基化所形成的糖链结构。其中，细胞的类型也是决定糖基化程度和形式的主要因素。

毕赤酵母作为一种成功的外源基因表达系统，其应用越来越广泛。毕赤酵母表达体系表达出的野生型cC是非糖基化蛋白，因此如何对野生型cC进行糖基化，而且使糖基化cC的表达量最大化是本领域技术人员不断探索的课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂（chicken cystatin, cC）的糖基化方法，及能够使糖基化cC的表达量最大化的发酵条件。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其步骤如下：

1）用定点突变技术构建野生型cC的I108T突变体：通过PCR的方法在野生型cC的cDNA的两端添加XhoⅠ和XbaⅠ的切割位点序列；用定点突变技术对两端添加XhoⅠ和XbaⅠ切割位点序列的野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asn106-Ile108突变为Asn106-Thr108，得到野生型cC的I108T突变体； 

2）利用pPICZαA载体构建重组质粒：利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZαA质粒载体，通过T₄ DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒；

3）糖基化cC 在毕赤酵母中的表达：将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用AvrⅡ线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基（1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖）中活化，25 ℃或30 ℃，250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中25 ℃或30 ℃、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000× g 离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中， 30 ℃，250rpm 诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h 以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液；