[发明专利]一种针对靶标的即时定量分析方法

摘要

本发明公开了一种针对靶标的即时定量分析方法，包括如下步骤（1）根据靶标选择合适的核酸适体，并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A，以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B；在链A、链B上分别修饰水凝胶单体；（2）将修饰单体的链A、链B聚合，并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶，同时将信号放大分子，包埋在该水凝胶结构中；（3）在水凝胶中加入靶标，靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子；（4）滑动芯片中放置溶液相底物，信号放大分子作用于溶液相底物，催化产生可由滑动芯片读出的信号分子；（5）记录检测结果。该方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点。

主权项

一种针对靶标的即时定量分析方法，用于可卡因检测，包括如下步骤：（1）合成丙烯酸亚磷酰胺单体（2）甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体，具体合成的序列见表1；合成结束后，将上述CPG转移至2 mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5 mL甲胺：氨水=1:1的溶液，在65℃下氨解30 min，使DNA从CPG上切割下来；氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清；向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3 mol/L NaCl，于‑20℃冰箱进行酒精沉淀30 min；酒精沉淀完毕后，在14,000 rpm的转速下离心10 min，弃上清；将得到的粗产物纯化；定量后真空浓缩；（3）水凝胶的制备将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液，分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED，即0.05 g过硫酸铵溶解至0.5 ml超纯水和25 μL TEMED溶解于0.5 mL超纯水；将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10 min，加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15 min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS‑A、PS‑B；将PS‑A与PS‑B按照1:1混合后，加入反应缓冲液，之后加入Au@PtNPs，振荡混匀后再加入与PS‑A、PS‑B浓度比为1:1:0.6的linker 核酸适体；重复振荡、加热步骤，直至得到包裹有Au@PtNPs的三维交联水凝胶；（4） 制作滑动芯片（5）DNA水凝胶可视化定量检测利用缓冲液配制靶标溶液，并加入到装有水凝胶的离心管中；将离心管转移至摇床上，于30℃，150 rpm的转速下进行充分反应：将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中，30℃条件下反应1小时，释放出Au@PtNPs；反应结束后，取反应上清液用于滑动芯片催化反应；分别在加样孔，底物孔，染料孔加入反应上清液，H2O2和罗丹明6G，滑动芯片，使Au@PtNPs与H2O2接触并催化H2O2产生O2，根据产生气体量进行读数，并记录数据。