[发明专利]一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法

摘要

一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法属于城市污水处理中影响因素范畴。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，具体涉及试剂的制备、标准曲线的测定、污泥的预处理、蛋白质的提取与测定等步骤。本发明提供了一种简捷、高效测定污泥中蛋白质含量的方法。

主权项

一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法，其特征在于：1)试剂的制备：将0.1000g考马斯亮蓝G‑250溶于50ml体积百分比浓度为95%乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85%的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液，使用时，按体积比为1:5的比例用蒸馏水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸馏水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；2)标准曲线的测定：称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，并移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100μg/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL牛血清蛋白溶液，不足1ml者，添加0.15mol/L的NaCl溶液使成1ml；然后加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀；显色5‑8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线；3)污泥的预处理：取50ml污泥样品于离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液Na3PO4浓度为0.05mol/L，NaCl浓度为0.15mol/L且pH值为7，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min；4)蛋白质的提取：将预处理的污泥放在80℃水浴锅内，加热30min，每隔10min将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定，剩余污泥测定MLSS和MLVSS；5)蛋白质的测定：取一定体积待测溶液于试管中，加入0.15mol/L 的NaCl溶液使成1ml；再加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀，另取1ml NaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5‑8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。