[发明专利]一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于城市生活污水处理与再生领域，具体涉及污泥中蛋白质的提取与测定方法。

背景技术

随着我国城市化、工业化进程的加快，水污染及生态环境不断恶化，给人民的生产生活带来严重影响。近年来，国家加大了对水环境的治理力度，污水处理得到了很大提高，然而所面临的水污染问题仍没有得到根本解决，其中最主要的就是氮磷的去除问题。

污水的脱氮除磷主要采用活性污泥法和生物膜法，控制污水处理效果的参数主要有T、pH、DO、SRT等，并且随着研究的深入，研究人员发现，通过测量污泥中的蛋白质和多糖的含量，亦能够反映其处理效果，因此人们开始对污泥的组分进行分析研究。

胞外聚合物，又称EPS，是微生物在一定条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的聚合化合物，包括荚膜、粘液层以及其他表面物质。EPS具有复杂的化学组成，包括蛋白质、多糖、核酸、糖醛酸、脂类、氨基酸、腐殖酸等物质，其中蛋白质和多糖是其主要成分，占EPS总量的70%～80%。EPS具有重要的生理功能，对于污泥的物理化学性质产生重大影响，可影响污泥的表面特性、污泥的絮体结构、污泥表面电荷、絮凝过程、沉降性能以及脱水过程，同时影响污泥对金属离子、非金属离子和大分子物质的吸附性能，在废水生物处理领域有较好的研究价值和应用前景。

胞外聚合物是MBR膜污染防治的一个重点内容，同时适量的EPS能够促进污泥的颗粒化，并且对重金属的吸附和生物除磷都有较好的效果，因此准确测定EPS中各种成分及含量的关系，是分析研究其作用的重要前提条件。

发明内容

本发明旨在寻找一种简捷、高效的提取方法，便于确定EPS中蛋白质的含量。

本发明采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。具体操作步骤如下：

1)试剂的制备：将0.1000g考马斯亮蓝G-250溶于50ml体积百分比浓度为95%乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85%的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液，此储备液放置在4℃冰箱中，可稳定保存6个月。使用时，按体积比为1:5的比例用蒸馏水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸馏水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；

2）标准曲线的测定：首先确定牛血清蛋白的纯度，配制浓度为100ug/ml的蛋白溶液。所购牛血清蛋白纯度≥98%，因此可称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，并移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100μg/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL牛血清蛋白溶液，不足1ml者，添加0.15mol/L的NaCl溶液使成1ml；然后加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀；显色5-8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线；标准曲线如图1所示。

3）污泥的预处理：取50ml污泥样品于离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液Na₃PO₄浓度为0.05mol/L，NaCl浓度为0.15mol/L且pH值为7，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min；

4）蛋白质的提取：将预处理的污泥放在80℃水浴锅内，加热30min，每隔10min将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定，剩余污泥测定MLSS和MLVSS；

5）蛋白质的测定：取一定体积待测溶液于试管中，加入0.15mol/L的溶液使成1ml；再加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀，另取1mlNaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5-8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。