[发明专利]一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法

摘要

本发明公开了一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法，包括以下步骤：首先是反应液配制；然后是AGEs纯化；最后是AGEs产物检测。采用本发明技术方案，用AGEs刺激内皮细胞后，能降低内皮细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性，损伤内皮细胞，具有较强的细胞毒性作用；制备方法简单、制备成本低廉，克服了采用静态反应的缺点，适合中小实验室采用。

主权项

一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1）反应液配制: 将5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）与浓度为50mmol/L的d‑葡萄糖溶于含EDTA(0.5mmol/L)的PBS(PH7.4)中，混匀，0.22uM滤膜无菌过滤后，放入自制反应装置中，37oC水浴恒温，用微量循环泵使反应液循环流动，孵育至设定时间取出，用截留分子量68kd以下的透析膜充分透析24h，每4h更换透析液1次，以去除未结合的葡萄糖，收集产物置冰箱保存，以备葡聚糖凝胶纯化用;对照BSA中不含葡萄糖，其它条件一致；步骤2）AGEs纯化: 用葡聚糖凝胶Sephadex‑G200纯化AGEs产物；称取凝胶颗粒3g, 加入过量蒸馏水中, 室温放置24小时, 用磷酸盐缓冲液( pH =7. 4, 0. 2mo l/ L )平衡10倍体积以上,装柱( 10 cm ×25 cm ), 连接蠕动泵和自动部分收集器、紫外线检测仪, 用PBS平衡过夜；次日, 取透析过的AGEs 适量缓慢加入柱床顶部, 用PBS洗脱,收集洗脱液，分别测定紫外280 nm 吸光度和AGEs溶液的荧光值, 收集第1峰浓缩, 用考马斯亮兰法测定蛋白含量,0.22uM滤膜过滤除菌, 取少量样品供检测用，其余样品封口后置冰箱冻存;步骤3）AGEs产物检测：用荧光分光光度法鉴定。