[发明专利]一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备晚期糖基化终产物的方法，具体涉及一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法。 

背景技术

糖尿病（Diabetic Mellitus, DM）血管病变（大血管病变、微血管病变）是糖尿病最常见的慢性并发症，也是2型糖尿病的主要致残、致死原因。DM血管病变学说较多，其中晚期糖基化产物学说（Advance Glycation End Products，AGEs）是DM血管病变的主要致病学说[1]。 

糖尿病患者体内长期存在的高血糖状态被认为是DM血管并发症的关键始动因素，所以严格控制血糖水平是降低糖尿病血管并发症的主要措施，但临床上发现即使给予有效的胰岛素治疗且血糖控制良好的病人，其血管并发症并未停止发展，即所谓“高血糖记忆”状态，这种现象与糖尿病患者体内长期的高血糖状态产生的高水平不可逆的强活性物质即晚期糖基化产物（advance glycation end products, AGEs）有关。AGEs 的形成又称为蛋白质非酶糖基化反应，是指体内蛋白质自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应生成稳定的共价化合物。该过程主要分为3 个步骤: 首先是游离氨基与糖分子中的醛基反应形成Schiff 碱，然后Schiff 碱发生重排产生可逆的早期糖基化产物-Amadori产物（包括果糖胺等多种产物），最后Amadori 产物再与其他游离氨基基团反应并进一步发生复杂的分子重排和脱水反应，形成不可逆的深度糖基化终末产物AGEs。这个反应是由法国科学家Maillard 在1912 年发现的，因此又称为Maillard 反应。AGEs 是许多不同化合物的总称，由荧光物质和非荧光物质组成，目前已经鉴别出体内20 几个AGEs，包括羧甲基赖氨酸（CML），苯妥西定，蛋白交联产物等。AGEs 可通过“双打击”模式损伤血管，AGEs 与RAGE 结合后，激活NF-kB 等信号分子，导致细胞发生炎症（第1 次打击），而聚集在炎症区域的吞噬细胞通过髓过氧化物酶可产生CML，又进一步损伤血管（第2 次打击）；AGEs 还能通过直接形成交联蛋白加速动脉硬化，改变基质成分，引起血小板聚集，造成血管弹性减小、血管顺应性降低并产生异常脂蛋白代谢从而影响心血管系统的功能。 

AGEs作为常规细胞毒性试剂，在DM血管病变分子机制的研究中具有广泛应用。大量细胞水平研究采用AGEs作为刺激剂，研究其影响血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞等的功能，以阐明DM血管病变产生的病理生理机制及寻找药物作用靶点。因此，高质量AGEs作为研究试剂，对研究结果的可靠性、准确性以及其重现性非常重要。目前，Sigma公司已有AGEs成品出售，但其价格非常昂贵,一般实验室难以承受。国内许多实验室为减少成本，一般采用自我制备方法获得AGEs，但我们发现，这些实验室其自制AGEs时均采用静态反应法制备[2,3,4,5]：即用一定浓度的牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA）和葡萄糖（G）液混合，置于37℃，培养一定时间，测定其荧光强度的改变。这一方法的最大缺点是忽视了血液循环的基本事实，不能很好反映体内蛋白质非酶糖化反应的真实状态，因而其AGEs质量也不能得到保障，影响后续研究数据的可靠性。 

基于此，我们发明了一种利用体外循环装置，模拟体内非酶糖基化反应过程制备晚期糖基化终产物的方法，该法制备出的AGEs质量稳定，生物活性高，经济，适合中小实验室自我制备，作为研究试剂。 

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法。 

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 

一种制备晚期糖基化终产物的体外动态循环方法，包括以下步骤：

步骤1）反应液配制: 将5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）与浓度为50mmol/L的d-葡萄糖溶于含EDTA(0.5mmol/L)的PBS(PH7.4)中，混匀，0.22uM滤膜无菌过滤后，放入自制反应装置中，37^oC水浴恒温，用微量循环泵使反应液循环流动，孵育至设定时间取出，用截留分子量68kd以下的透析膜充分透析24h，每4h更换透析液1次，以去除未结合的葡萄糖，收集产物置冰箱保存，以备葡聚糖凝胶纯化用;对照BSA中不含葡萄糖，其它条件一致；