[发明专利]一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用

摘要

本发明公开一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用，选取MyoD1基因作为影响阿勒泰羊产肉量的候选基因，利用PCR-SSCP技术检测阿勒泰羊品种中MyoD1基因的遗传结构，分析和判断其与绵羊产肉量的相关关系，通过绵羊MyoD1基因的DNA序列，自行设计两对特异性引物，利用PCR-SSCP技术对新疆阿勒泰羊MyoD1基因进行多态性检测，并与产肉性状进行相关性分析，从而找出与阿勒泰羊产肉量显著相关的分子标记，本发明用以提高阿勒泰羊的产肉性能，从而大大加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的速度，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实际应用价值。

主权项

一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法，其特征在于，具体方法步骤如下：(1)阿勒泰羊基因组DNA提取：采集阿勒泰羊血样5ml，提取DNA，在‑20℃保存；0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断DNA的提取质量；(2)阿勒泰羊MyoD1基因特异性引物设计：利用绵羊MyoD1基因的DNA序列(GenBank登录号：NM_001009390)，自行人工设计两对特异性引物，两对特异性引物序列分别为：引物1：上游引物F：5′‑CCGCTGTTTACTGTGGG‑3′；下游引物R：5′‑GCTGGTTTGGGTTGCT‑3′；引物2：上游引物F：5′‑AGCAACCCAAACCAGC‑3′下游引物R：5′‑ATGCCGTCGGAACAGT‑3′；(3)阿勒泰羊MyoD1基因的PCR扩增：根据设计的两对引物，特异性扩增阿勒泰羊MyoD1基因的两个片段；PCR反应体系为：Mi x10.0μl，上下游引物各0.4μl，DNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；反应条件为：94℃预变性5mi n，94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸1mi n，循环31次，72℃延伸5mi n，4℃保存；特异性扩增的两个PCR产物均由1％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量；(4)SSCP检测：分别对阿勒泰羊MyoD1基因的两个PCR产物进行SSCP检测，筛选具有多态性的PCR扩增片段；取3μl PCR产物与7μl的98％去离子甲 酰胺的变性剂混合，98℃变性10min后冰浴10min，使之保持变性状态；变性后PCR产物用8％非变性聚丙烯凝胶(polyacrylamide gel，PAG)180V电泳20h，银染显色后，于凝胶成像仪白光下照射，观察条带的大小，判断有无多态性，有多态的判断基因型；(5)DNA测序，找出阿勒泰羊MyoD1基因突变位点；对于SSCP检测中具有多态性的基因，将其不同基因型的PCR产物进行DNA测序，用以判断突变碱基和位点；(6)突变碱基与阿勒泰羊产肉量进行关联分析，确定影响阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记，并对阿勒泰羊中多态基因不同基因型间的个体体重进行显著性检验；经显著性检验，P＜0.01时差异极显著；P＜0.05时差异显著；P＞0.05时差异不显著；若差异显著或极显著，则说明导致基因扩增片段出现多种基因型的突变碱基是显著影响阿勒泰羊产肉量的基因突变位点，该多态基因可作为影响决定阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记。