[发明专利]卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法

摘要

本发明涉及卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法，将细胞HTB161A2在RPMI补充性培养基中贴壁培养收集上清液；收集0.5ml磁珠子并用包被缓冲液洗；将磁珠子重悬、过滤、洗脱，洗脱下的物质收集在离心管中，收集滤出液，所述的滤出液即为抗原肽的溶液，本发明所用的方法是一种称为直接的生化方法，即用免疫亲和方法从肿瘤细胞或组织中纯化MHC/多肽复合分子，并从中洗脱出MHC结合的抗原肽，这些抗原肽可被潜在地用于抗体治疗，或产生卵巢癌特异的CTLs，或制备肿瘤疫苗；也可发展出用于诊断的试剂盒。

主权项

一种卵巢癌特异的肿瘤抗原肽的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：i.将细胞HTB161A2在RPMI补充性培养基中贴壁培养，培养基中加入10%胎牛血清，将细胞的浓度调节在0.5×10⁶个/ml；ii.倒去培养液，用预冷的1×PBS缓冲液洗细胞3次，用3ml细胞裂解缓冲液将裂解液冲洗和收集细胞，且在4℃下旋转反应1小时。悬液以高速15Krpm，20分钟下离心，收集上清液保存在‑80℃备用；iii.收集0.5ml磁珠子并用包被缓冲液洗4次；iv.将磁珠子与0.42ml，4.8mg/ml的BB7.2抗体孵育,加2.08ml，3M的(NH₄)₂SO₄，在3.26ml包被缓冲液中室温孵育72小时；v.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同体积的含0.5%BSA与0.05%Tween20的PBS并在室温中再孵育48小时；vi.用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗磁珠子，将磁珠子重悬在2ml含有0.02%叠氮化钠的PBS中备用；vii.1×10⁹个在裂解液中的卵巢癌细胞，以100,000×g，离心1小时，丢弃沉淀，将上清用0.22‑μm过滤器过滤后与BB7.2抗体连接的磁珠子在4℃旋转孵育24小时，装柱后用50ml洗液洗4遍；viii.将洗后的珠子用2ml10%的HAC洗脱BB7.2抗体连接的磁珠子；ix.洗脱下的物质收集在离心管中，加10%HAC后煮沸5分钟；x.把洗脱下的物质转移到预湿的孔径为5kDa的Ultrafree‑CL膜上，3500×g在4℃离心5小时，收集滤出液，所述的滤出液即为抗原肽的溶液。