[发明专利]一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法以及伪型病毒的用途，制备方法包括（1）携带F、HN基因的重组质粒的构建；（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV-PP的制备。其中，扩增F基因和HN基因的两对引物分别为F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4。本发明拟建立一种敏感、快速、适合大批样本检测的新城疫病毒中和抗体检测方法，以期替代传统的中和抗体检测手段，为疫病的快速诊断、疫苗效果评价等提供有益工具。

主权项

一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法，包括以下步骤：（1）携带F、HN基因的重组质粒的构建①提取新城疫病毒F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和禽逆转录病毒（AMV）反转录酶反转录为cDNA；②合成扩增F基因和HN基因的两对引物：F‑sense与F‑antisense、HN‑sense与HN‑antisense，引物序列分别为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4；③以步骤①中获得的cDNA为模板，用步骤②合成的引物F‑sense与F‑antisense、HN‑sense与HN‑antisense PCR扩增F基因和HN基因；④用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切F基因片段，用BamHI、XhoI酶切HN基因片段，然后连接到用相应酶酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，进行核酸测序，确认重组子的读码框正确，分别命名为pc‑F和pc‑HN，然后将两重组质粒转染人胚胎肾细胞，即293T；48小时后，用质量浓度为0.05%的胰酶消化细胞，涂布于载玻片，用预冷的丙酮固定；以NDV全病毒免疫的鸡血清作为一抗进行免疫荧光染色，确认F和HN基因能够正常表达；（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV‑PP的制备提前一天将293T细胞在无菌条件下铺于10cm细胞培养皿中，待细胞单层长至80%左右时，取质粒pc‑F、pc‑HN及携带有荧光素酶同时缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒载体pNL4‑3‑Luc‑R‑E‑各10μg，利用转染试剂HiTrans转染293T细胞；三种质粒与50μL转染试剂混合，室温孵育30分钟后，缓慢加入10cm细胞培养皿中；48‑72小时后，收获转染细胞上清，通过0.45μm滤膜过滤后，收集转染细胞培养上清放置‑80℃保存；阳性对照组用表达水泡性口炎病毒囊膜蛋白VSV‑G质粒和pNL4‑3‑Luc‑R‑E‑各10μg转染293T细胞；阴性对照用pcDNA3.1（+）空质粒和pNL4‑3‑Luc‑R‑E‑各10μg转染293T细胞。