[发明专利]一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途，属于病毒的制备与应用领域。

背景技术

新城疫是一种可引起多种禽类发生群体死亡的急性、高度接触性传染病，给养禽业造成了巨大的经济损失。该病在世界范围内广泛流行，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的疫病。对其进行迅速、准确的血清学诊断不仅可以有效评价动物机体的感染状态，也是控制该病流行的必要前提。目前对该病常用的血清学诊断方法包括血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及全病毒中和试验（VN）。在这些方法中，VN所检测的是能够使机体免受病毒感染的中和性抗体，因此与HI、ELISA相比，VN检测结果更能体现出动物机体阻止病毒感染的状态。

VN通常是在细胞中进行检测。检测之前需事先培养支持NDV复制的细胞，如鸡成纤维细胞CEF或DF1，将待检测样品与一定剂量的病毒孵育后，接种于细胞中，1-4天后，观察细胞是否有病毒感染导致的病变，或用染料染色，检查病毒感染细胞所产生的空斑数量或大小，继而确定所检测样品（血清或抗体）是否具有中和活性及其中和效价。这种检测方法具有如下几个缺点：

（1）实验周期较长，与血清孵育的病毒接种细胞后，往往要1-4天才能出现细胞病变（不同毒力的毒株产生细胞病变的时间有所差异）。长时间的检测过程不利于第一时间对于病毒感染做出诊断，特别是在病毒大范围流行期间，有可能延误疫病的防治。

（2）敏感性较差。该方法的检测阈值较高，若血清样品数量较少，或中和抗体效价较低，则无法应用该方法。

（3）结果判断过于主观。病毒接种细胞后产生的细胞病变或者空斑的减少需要主观判断，没有一个客观、统一的标准。

本发明检测中和抗体，有效减少了检测所需时间（不超过48小时）；由于本发明采用荧光素酶的放大系统，即便样品中含有极少量的中和抗体，也能检出，且理论上单次同时检测的样品数量没有上限，因此更适合大规模，高通量的样品检测；本项发明测定荧光素酶表达水平即可作为判定血清的中和效价的统一标准，因此判定结果更加客观；本发明应用过程中，不涉及活病毒的操作，避免了对其他实验材料或动物的交叉感染，因此具有生物安全优势。

发明内容

由于传统的基于细胞或者鸡胚的中和试验方法具有以上诸多弊端，本发明拟建立一种敏感、快速、适合大批样本检测的新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）中和抗体检测方法，以期替代传统的中和抗体检测手段，为疫病的快速诊断、疫苗效果评价等提供有益工具。本发明提供了一种新城疫病毒伪型病毒（pseudotyped particle,PP）的制备方法及其用途。

本发明通过以下技术方案实现：

1.新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）属于副黏病毒科，病毒粒子表面有血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuminidase,HN）和融合蛋白(fusion protein,F)两种表面囊膜蛋白。携带F、HN基因的重组质粒的构建。

（1）提取NDV F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和禽逆转录病毒（AMV）反转录酶反转录为cDNA；

（2）合成扩增F基因和HN基因的两对引物：F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4；

（3）以步骤（1）中获得的cDNA为模板，用步骤（2）合成的引物F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense PCR扩增F基因和HN基因；

（4）用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切F基因片段，用BamHI、XhoI酶切HN基因片段，然后连接到用相应酶酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1（+）（英俊公司生产）上，进行核酸测序，确认重组子的读码框正确，分别命名为pc-F和pc-HN，然后将两重组质粒转染人胚胎肾细胞（293T）。48小时后，用质量浓度为0.05%的胰酶消化细胞，涂布于载玻片，用预冷的丙酮固定。以NDV全病毒免疫的鸡血清作为一抗进行免疫荧光染色，确认F和HN基因能够正常表达。

2.整合有NDV囊膜蛋白的伪型病毒（命名为NDV-PP）的制备