[发明专利]一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途

权利要求书

1.一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法，包括以下步骤：

（1）携带F、HN基因的重组质粒的构建

①提取新城疫病毒F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和禽逆转录病毒（AMV）反转录酶反转录为cDNA；

②合成扩增F基因和HN基因的两对引物：F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4；

③以步骤①中获得的cDNA为模板，用步骤②合成的引物F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense PCR扩增F基因和HN基因；

④用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切F基因片段，用BamHI、XhoI酶切HN基因片段，然后连接到用相应酶酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，进行核酸测序，确认重组子的读码框正确，分别命名为pc-F和pc-HN，然后将两重组质粒转染人胚胎肾细胞，即293T；48小时后，用质量浓度为0.05%的胰酶消化细胞，涂布于载玻片，用预冷的丙酮固定；以NDV全病毒免疫的鸡血清作为一抗进行免疫荧光染色，确认F和HN基因能够正常表达；

（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV-PP的制备

提前一天将293T细胞在无菌条件下铺于10cm细胞培养皿中，待细胞单层长至80%左右时，取质粒pc-F、pc-HN及携带有荧光素酶同时缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒载体pNL4-3-Luc-R^-E^-各10μg，利用转染试剂HiTrans转染293T细胞；三种质粒与50μL转染试剂混合，室温孵育30分钟后，缓慢加入10cm细胞培养皿中；48-72小时后，收获转染细胞上清，通过0.45μm滤膜过滤后，收集转染细胞培养上清放置-80℃保存；阳性对照组用表达水泡性口炎病毒囊膜蛋白VSV-G质粒和pNL4-3-Luc-R^-E^-各10μg转染293T细胞；阴性对照用pcDNA3.1（+）空质粒和pNL4-3-Luc-R^-E^-各10μg转染293T细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法制备的新城疫病毒伪型病毒。

3.如权利要求2所述的新城疫病毒伪型病毒在新城疫病毒中和抗体检测中的应用。