[发明专利]一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法

摘要

本发明提供的一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法，在于改变传统大肠杆菌疫苗注射剂型，采用微囊包被技术制备一种新型口服制剂，使大肠杆菌疫苗的免疫接种途径更加简单方便，提供反刍动物用大肠杆菌口服疫苗。采用微囊包被技术制备口服疫苗与注射疫苗产生同样的体液免疫；制得的产品颗粒饱满粒径均匀、平均粒直径为5.23±2.70μm，包埋率达到75.23%；以海藻酸钠作为包被壁材，制得的微胶囊颗粒，具有抵御胃酸的作用。

主权项

一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法，其特征在于：分步骤实施;步骤1芯材的制备：1)取冻干菌种，接种于灭菌的肉汤中，37℃培养20h，取此菌液，注射于实验小白鼠的腹腔内待死亡，无菌剖取肝脏，匀浆，涂布于麦康凯培养基上，37℃培养24 h，用10%脱纤维蛋白的绵羊鲜血琼脂平板继续划线分纯至2代，经革兰氏染色、镜检、纯化，挑取光滑圆整菌落，接种于鲜血琼脂斜面，作为一级种子菌，再将其接种于肉汤内，37℃培养20h，纯粹检验合格，作为二级种子，4℃保存、备用；2）取二级种子菌液接种于营养琼脂平皿，置于37℃恒温箱，培养24 h，用含5‰甲醛、0.85%生理盐水冲洗菌苔，收集菌液，以3000rpm离心，去除培养基杂质，再以10000rpm离心，收集菌体，反复离心三次，用麦氏比浊法调整菌液浓度至200亿菌/ml，置于37℃恒温箱、振荡数次、灭活48h、得灭活菌液，配苗；3）取灭活菌液与含蜂胶30mg/ml的乙醇提取液等体积混合，以3000rpm搅拌均匀，得褐色菌苗悬液，即为灭活抗原组织，4℃保存；步骤2微囊包被的影响因素试验：设海藻酸钠浓度、芯壁比、乳化剂含量、进风温度、均质速度的不同梯度，以包埋率、粒直径为评价指标，进行单因素试验；1）在固定芯壁比为1:1，乳化剂含量为0.5%，进风温度200℃，出风温度80℃，进样速率55ml/h，10000rpm均质15min的条件下，改变海藻酸钠浓度为1%、2%、3%、4%、5%，测定其包埋率，得壁材浓度为1%‑3%；2）在固定海藻酸钠浓度为2%，乳化剂含量为0.5%，进风温度200℃，出风温度80℃，进样速率55ml/h，10000rpm均质15min的条件下，改变芯壁比为1:1、1:2、1:3、1:5、1:8、1:10，测定其包埋率，得芯壁比：1:1‑1:5；3）在固定海藻酸钠浓度为2%，进风温度200℃，出风温度80℃，进样速率55ml/h，10000rpm均质15min的条件下，改变乳化剂含量为0.5%、1%、1.5%、2%、4%、6%，测定其包埋率，得乳化剂含量为5‑7%；4）在固定海藻酸钠浓度为2%，乳化剂含量为0.5%，出风温度80℃，进样速率55ml/h，10000rpm均质15min的条件下，改变进风温度为120℃、140℃、160℃、180℃、200℃、220℃，测定其包埋率，得进风温度为180‑220℃；5）在固定海藻酸钠浓度为2%，乳化剂含量为0.5%，进风温度200℃，出风温度80℃，进样速率55ml/h，改变均质速度为10000 rpm、13000 rpm、16000 rpm、19000rpm、22000rpm，测定其包埋率，得均质速度为16000rpm；步骤3将海藻酸钠磁力搅拌溶解过夜；在常压、115℃、10 min条件下，将浓度为2%海藻酸钠与灭活抗原组织按3:1混合，添加乳化剂含量4%，保护剂含量2%，置于捣碎机，乳化10 min，再置于均质机上，以16000 rpm均质，保温30 min，将脱气后的乳状液，泵入喷雾干燥机内，以进风温度为200℃，出风温度为90℃，蠕动泵速率为70 ml/h，进行喷雾干燥即得疫苗产品；其中乳化剂为吐温80，保护剂，用1%聚乙烯吡咯烷酮与10%乳糖溶液混合均匀制得；步骤4疫苗安全性评价：疫苗口服饲喂实验大鼠，无不良反应，丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶含量与对照组之间差异不显著，为P＞0.05； 步骤5疫苗的免疫评价：制得微胶囊的含菌量为7.52×1011个菌/g干粉，口服免疫大鼠，经ELISA试验检测免疫血清抗体效价，试验组在免疫后7天即可产生抗体，免疫后28天抗体效价出现高峰。