[发明专利]一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法

摘要

本发明公开一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法，该方法包括（1）细菌脂多糖水解为细菌O-特异多糖粗糖，（2）细菌O-特异多糖粗糖的纯化，其纯化依次经过第一次超滤、乙醇分级沉淀、第二次超滤、阴离子交换；阴离子交换是在第二次超滤获得的超滤浓缩液中加入缓冲液，上样于阴离子交换柱，用缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液；（3）目标物溶液的浓缩冻干即得纯化的细菌O-特异多糖。本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适于规模化、产业化生产，而且生产获得的产品杂质含量低，纯度高，达到了进一步开发为人用疫苗的要求。

主权项

一种规模化制备及纯化细菌O‑特异多糖的方法，包括以下步骤：（1）细菌脂多糖水解为细菌O‑特异多糖粗糖将细菌脂多糖用注射用水溶解至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入酸至酸终浓度为0.2～5%，沸水浴维持30～120min，收集上清液，并将上清液pH调至6.0～8.0，得到细菌O‑特异多糖粗糖；或将细菌脂多糖用注射用水溶解至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入氢氧化钠至氢氧化钠终浓度为0.2～1mol/L，20～45℃水浴维持1～12小时，收集上清液，并将上清液pH调至6.0～8.0，得到细菌O‑特异多糖粗糖；（2）细菌O‑特异多糖粗糖的纯化①第一次超滤：将细菌O‑特异多糖粗糖离心收集上清液，采用1～10KD超滤膜将上清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，所用的注射用水体积为上清液体积的2～10倍；②乙醇分级沉淀：超滤浓缩液1中加入盐1和乙醇，其中盐1的终浓度为0.1～0.5mol/L，乙醇的终浓度为20～80%，搅拌60～70min，2～8℃条件下沉淀6～12小时后，离心收集上清液；③第二次超滤：采用1～10KD超滤膜将上清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液2，所用的注射用水体积为上清液体积的2～10倍；④阴离子交换：超滤浓缩液2中加入终浓度为0.001～0.2mol/L的缓冲液得混合液，混合液的pH调至5.0～8.5，混合液上样于阴离子交换柱，用终浓度为0.001～0.2mol/L，pH为5.0～8.5的缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由缓冲液和盐2混合而成，洗脱液的pH为5.0～8.5，洗脱液中缓冲液的终浓度为0.001～0.2mol/L，盐2的终浓度为0.01～0.2mol/L；（3）目标物溶液的浓缩冻干：将目标物溶液采用1～10KD超滤膜，用注射用水超滤后，低温真空干燥即得纯化的细菌O‑特异多糖；超滤时所用注射用水体积为目标物溶液体积的2～10倍。