[发明专利]一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的，涉及规模纯化制备细菌O-特异多糖的方法。

背景技术

革兰氏阴性细菌的特异多糖是脂多糖的一部分。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分之一，也是细菌内毒素的主要成分。脂多糖虽然是一种保护性抗原，但也是一种毒力因子，美国NIH的Robbins等经过大量试验提出LPS水解后得到的O-特异多糖(OSP)的型特异血清IgG抗体具有免疫保护性（Robbins JB,Chu C,Schneerson R,Hypothesis for vaccine development:protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the O-specific polysaccharide of their lipopolysaccharides.Clin Infect Dis,1992,15(2):346-361）。赵志强等用OSP制备成的结合物在安全性和免疫原性方面取得了可喜的结果（赵志强,杨朝辉等,甲型副伤寒结合疫苗的制备及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫性杂志,2006,26(11):1048-1052）。目前将LPS水解去掉毒性成分脂质A后得到的OSP制备成结合物已经成为许多肠道致病菌疫苗的研究方向。但已有的纯化方法多局限在先获得纯度较高的LPS后再水解得到合格的OSP，且对LPS的纯化步骤中多采用酶解、超速离心等方法（Edward K.Synthesis,characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified LPS of salmonella paratyphi A bound to Tetanus toxoid,with Emphasis on the role of O-Acetyl[J].Infection and immunity1996,64(7):2709-2715.），其缺点：酶解、超速离心的成本高，处理量小不易于规模化、产业化，且容易存在外源因子污染、残留（酶解）；另外，秦敏等人在纯化步骤采用的方法是先将LPS中核酸指标控制在10%以内，后水解得到OSP进一步用凝胶过滤的方法才能将OSP中核酸指标控制在0.5%以内,蛋白指标控制在1～2%（秦敏.甲型副伤寒沙门氏菌LPS提取和O-SP纯化.微生物学免疫性进展2005,33(1)27-31），此方法要求对OSP纯化前必须将先LPS中核酸指标控制在10%以内，否则难以达到后续的效果，因此，存在对OSP纯化前的指标要求苛刻，整体工序复杂，后续的凝胶过滤法也存在上样体积小、流速小等缺陷，不利于实现规模化、产业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在制备纯化成本高、整体工序复杂、处理量小不易于规模化、产业化、或制品中易残留外源因子、对OSP纯化前的指标要求苛刻等技术问题，其目的是提供了一种方便、重复性好、利于规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法。

本发明所提供的一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法，包括以下步骤：

（1）细菌脂多糖水解为细菌O-特异多糖粗糖

将细菌脂多糖用注射用水溶解至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入酸至酸终浓度为0.2～5%，沸水浴维持30～120min，收集上清液，并将上清液pH调至6.0～8.0，得到细菌O-特异多糖粗糖；或将细菌脂多糖用注射用水溶解至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入氢氧化钠至氢氧化钠终浓度为0.2～1mol/L，20～45℃水浴维持1～12小时，收集上清液，并将上清液pH调至6.0～8.0，得到细菌O-特异多糖粗糖；

（2）细菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：将细菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，采用1～10KD超滤膜将上清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，所用的注射用水体积为上清液体积的2～10倍；

②乙醇分级沉淀：超滤浓缩液1中加入盐1和乙醇，其中盐1的终浓度为0.1～0.5mol/L，乙醇的终浓度为20～80%，搅拌60～70min，2～8℃条件下沉淀6～12小时后，离心收集上清液；

③第二次超滤：采用1～10KD超滤膜将步骤（2）②乙醇分级沉淀获得的上清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液2，所用的注射用水体积为上清液体积的2～10倍；