[发明专利]一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法

摘要

本发明涉及一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒（SrMV）的方法。通过提取甘蔗植株叶片总RNA、进行反转录反应（RT）获得模板、利用高粱花叶病毒不同株系外壳蛋白基因保守序列简并引物进行聚合酶链式反应（PCR)、利用限制性内切酶NsiI和BsmI对PCR产物进行双酶切反应，用4%的低熔点琼脂糖凝胶电泳检测限制性内切酶条带长度多态性（RFLP）来鉴定是否感染SrMV及其株系类型。该方法将快速与简便的检测甘蔗高粱花叶病毒分离物不同株系。本发明的分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，克服了生物学鉴定和常规RT-PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、准确的SrMV不同病毒株系的检测方法。

主权项

一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，包括甘蔗叶片总RNA提取、简并引物设计、RT‑PCR扩增、限制性内切酶反应、电泳检测；其特征在于：（1）简并引物设计：扩增SrMV不同株系外壳蛋白基因保守序列的简并引物序列SrMV‑CPF和SrMV‑CPR如下：SrMV‑CPF：5'‑ACADCAGADGCAACRGCACAAGC‑3'SrMV‑CPR：5'‑CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC‑3'；（2）RT‑PCR扩增：RT反应：反转录反应体系总体积为10 μL，内含：2 μL 5×PrimeScript缓冲液，0.5 μL PrimeScript反转录酶混合液，0.5 μL Oligo dT 引物，2 μL Random 6 mers引物，2 μL甘蔗叶片总RNA模板，无RNase水补足到10 μL；反转录反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s灭活反转录酶；PCR扩增：PCR反应体系总体积为50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L简并引物SrMV‑CPF和SrMV‑CPR各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，1.0 μL cDNA，灭菌超纯水补足到50 μL；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris‑HCl  pH 8.3，15 mmol/L MgCl2；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸10 min；（3）限制性内切酶反应：应用NsiI和BsmI限制性内切酶进行双酶切反应，酶切反应体系总体积为20 μL，内含2.0 μL 10×酶切缓冲液，4.0 μL 纯化后PCR产物，NsiI和BsmI限制性内切酶各1.5 μL， 灭菌超纯水补足到20 μL；酶切反应条件：37 ℃酶切12 小时；65 ℃处理20 min，终止酶切反应，降至常温；（4）电泳检测：酶切反应结束后取5 μL反应液进行质量体积比为4.0 %的低熔点琼脂糖凝胶电泳，在0.5×电泳缓冲液环境中，80 V稳压电泳2 h，然后用凝胶成像系统观察并拍照，于电泳检测图中出现PCR产物酶切条带，表示该样品含SrMV；不出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。