[发明专利]龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法

摘要

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。一种龟甲DNA检测试剂盒包括样本前处理液及脱钙液，线粒体DNA提取体系，PCR反应体系，结果观察体系四部分组成。一种龟甲DNA鉴定方法，包括检测样本前处理，线粒体DNA提取，PCR引物设计与合成，建立PCR反应，结果判定五步。判断标准为同时出现100bp和400bp条带为正品龟甲，只出现一条或不出现均为伪品龟甲本发明建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点，能够准确同时区别鉴别龟甲和伪品的特异性。

主权项

一种龟甲DNA检测试剂盒，其特征是，它包含样本前处理液及脱钙液、线粒体DNA提取体系、PCR反应体系、结果观察体系。(1)样本前处理液及脱钙液(a)前处理液：去离子水。(b)脱钙液：0.5mol/L pH8.0EDTA。(2)线粒体DNA提取体系(a)裂解液：10m mol/L Tris‑HCl(pH8.0)，10m mol/L EDTA(pH8.0)，100m mol/L NaCl，2％SDS，40μg/ml蛋白酶K，0.039mol/L DTT。(b)沉淀液：饱和NaAC。(c)洗涤液：70％乙醇。(3)PCR反应体系(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，中华龟龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系：总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水；(4)结果观察体系(a)琼脂糖凝胶：1.5％琼脂糖。(b)标准分子量：100～2000bp的DNA Marker(可以选用其它种类的标准分子量，要求最大的不能超过2000bp，要显示出100bp和400bp)。