[发明专利]一种乳酸菌IIa类抗菌肽的PCR筛选方法

摘要

一种乳酸菌IIa类抗菌肽的PCR筛选方法，涉及一种抗菌肽的筛选方法。本发明是要解决传统的抗菌肽筛选方法存在的敏感性低的技术问题。本发明的方法为：一、IIa类抗菌肽聚类分析与筛选引物设计，PCR产物的获得；二、PCR产物载体连接与测序，获得乳酸菌IIa类抗菌肽。本发明PCR筛选的抗菌肽的基因序列与enterocin A的编码基因的同源性为99％，敏感性高。本发明应用于抗菌肽的筛选领域。

主权项

一种乳酸菌IIa类抗菌肽的PCR筛选方法，其特征在于乳酸菌IIa类抗菌肽的PCR筛选方法是按以下步骤进行的：一、根据Enterococcus faecium中编码抗菌肽enterocin A的entA基因33‑51位点和123‑142位点的序列设计一对种属特异性引物Group‑5F和Group‑5R，然后对乳酸菌基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；二、PCR产物采用凝胶回收试剂盒回收，将胶回收后的目的DNA，按照零背景快速连接试剂盒说明书操作，连接至载体pZeroblunt上，经菌体PCR鉴定确认是重组pZeroblunt质粒的阳性克隆菌时，在Ep管中加入200～300μL的重组pZeroblunt质粒的阳性克隆菌菌液，做好标记及密封，送到上海英俊生物有限公司，正反两个方向同时测序，然后将所得测序结果进行拼接，之后在NCBI数据库中进行比对，若PCR片段与Enterococcus faecium E5、E9等菌株中编码抗菌肽enterocin A的基因同源性达到99％，则为乳酸菌IIa类抗菌肽；其中，步骤一中Group‑5F的核苷酸序列为：5′‑GACACAACTTATCTATGGGG‑3′；Group‑5R的核苷酸序列为：5′‑TACAAGTAGTTGCCTTGGCC‑3′。