[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法

摘要

本发明公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌，经过变性、复性和层析，得到高纯度G-CSF原液。本发明的生产方法生产周期短，生产效率高，生产规模大，特别适于工业化生产，降低了生产成本。

主权项

一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括（1）对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，（2）对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，得到精制包涵体；（3）对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；（4）对变性所得物进行复性处理；（5）对复性所得物进行层析纯化处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：①.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养12‑14小时；②.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养9‑11小时；③.二级种子液培养：将一级种子液按增加1%的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100‑300rpm/min，通气30L/min，罐压0.1‑0.2bar，温度30℃，溶氧不低于50%，培养3‑5小时，至OD600值至为1.0‑2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；所述发酵罐培养包括如下子步骤：①.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度115℃，30min，发酵罐自动在线灭菌；②.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度30℃，发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30%以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100‑400L/min、罐压0.1‑0.3bar，培养4小时开始诱导表达；③.诱导发酵：诱导温度为37‑42℃，诱导4小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。