[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体来说是一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法。

背景技术

重组人粒细胞刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）是指特异作用于造血系统中粒祖细胞，促机其增殖，向成熟中性粒细胞分化，并维持细胞的存活及其生物功能的一种造血生长因子，是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子的一种。对骨髓移植时的中性白细胞增加、癌症化疗时引起的严重中性粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均有明显疗效。

采用基因工程技术重组G-CSF的生活学活性与天然的相似，可以大规模生产，以满足临床需要。目前，比较常用的方法是利用大肠杆菌表达外源蛋白，多以不溶性包涵体的形式存在，由于包涵体不具有生活学活性，因此还需要经过变性、复性处理，恢复其生物学活性，再经过纯化处理，得到原液。

中国专利文献CNY718739A公开了一种“重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法”，该方法包括：a.选用工程菌DH5α－PBV220－hGCSF菌株进行发酵培养；b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物；f.对超滤所得物进行进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其纯度达到98％以上、比活性不低于4.0×10⁸IU/mg。本制备方法为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。

然而，上述方法中，以工程菌DH5α－PBV220－hGCSF菌株作为种子，即使在培养时采用了抗生素氨苄青霉素以提高表达量，其所得rG-CSF蛋白占菌体总蛋白比例在40%左右，而且由于抗生素对环境的不友好，采用了抗生素技术的生产废液的处理成为新的问题。并且，其生产过程复杂，生产周期比较长，生产效率低，发酵罐规模只有20L不适合大规模生产。具体表现为：基本发酵时间为培养8小时，采用超声破菌时间长，分离洗涤5次，两次复性要超过116小时。由于洗涤和复性溶液成份复杂，给后续层析纯化增加了难度，使得第二次复性需要在2-8℃条件下复性96小时以上，且复性完后需经离心处理才能上柱。同时，采用超声破菌，控制超声功率和时间难度大,超声不足不能完全释放重组蛋白,而超声时间太长或功率太大,会使蛋白炭化。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种适合工艺化，能够提高生产量、缩短生产周期，是高密度快速生产重组人粒细胞刺激因子的方法。

本发明采用如下技术方案：

一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，依次包括（1）对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，（2）对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，得到精制包涵体；（3）对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；（4）对变性所得物进行复性处理；（5）对复性所得物进行不需离心分离直接进行层析纯化处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101；所述工程菌株的培养包括扩增培养和发酵罐培养，

其中扩增培养包括以下子步骤：

①.菌种复苏：将工程菌种接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养12-14小时；

②.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养9-11小时；

③.二级种子液培养：将一级种子液按增加1%的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气30L/min，罐压0.1-0.2bar，温度30℃，溶氧不低于50%，培养3-5小时，至OD₆₀₀值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；

所述发酵罐培养包括如下子步骤：

①.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度115℃，30min，发酵罐自动在线灭菌；