[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法

权利要求书

1.一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括（1）对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，（2）对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，得到精制包涵体；（3）对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；（4）对变性所得物进行复性处理；（5）对复性所得物进行层析纯化处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：

①.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养12-14小时；

②.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养9-11小时；

③.二级种子液培养：将一级种子液按增加1%的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气30L/min，罐压0.1-0.2bar，温度30℃，溶氧不低于50%，培养3-5小时，至OD₆₀₀值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；

所述发酵罐培养包括如下子步骤：

①.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度115℃，30min，发酵罐自动在线灭菌；

②.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度30℃，发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30%以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100-400L/min、罐压0.1-0.3bar，培养4小时开始诱导表达；

③.诱导发酵：诱导温度为37-42℃，诱导4小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。

2.如权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于：所述LB培养基的组份及其配比为：10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。

3.如权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基浓缩液的组份及其配比为：3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g KH₂PO₄·2H₂O+2000gNa₂HPO₄+500g NH₄Cl+250g NaCl+5000g葡萄糖+62.5g MgCl₂+6.25g CaCl₂。

4.如权利要求1至3中之一所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于：上述发酵罐培养子步骤②和③中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加补料培养基5L。

5.如权利要求4所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于：所述发酵补料培养基的组份及其配比为：100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。

6.如权利要求1至3中之一所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于所述步骤（2）中包涵体提取和包涵体洗涤子步骤为：

①包涵体提取：用25mmol/L Tris-HCl-EDTA溶液构成的重组人粒细胞刺激因子发酵菌裂解液将菌体悬浮，利用高压均质机加压到500-600bar进行匀浆破碎，然后用管式离心机连续流离心的方法收集G-CSF包涵体；

②包涵体洗涤：先用25mmol/L Tris-HCl+2M盐酸胍溶液+0.5%曲拉通X-100重组人粒细胞刺激因子包涵体洗涤液将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程离心收集沉淀，得精制G-CSF包涵体。

7.如权利要求1至3中之一所述的重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其特征在于所述步骤（3）对精制包涵体进行变性处理，是用20mmol/L Tris-HCl－10mmol/L DTT－8mol/L尿素将G-CSF包涵体进行溶解，然后离心收集上清液。