[发明专利]能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。本发明质粒能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因，本发明质粒为进一步利用质粒pXJM19通过分子手段改良简单节杆菌提供了依据，具有重要的实用意义。

主权项

1.一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：P3：5′- CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′  EcoRI；P4：5′- CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′    HindIII；反应体系为50μL，配比如下：PCR程序如下：95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；63℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存；再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；⑵构建游离表达载体pXJM19- ksdD将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19- ksdD，所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 μL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比为3:1~9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16 oC下，过夜反应；经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。