[发明专利]能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法及应用

权利要求书

1.一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：

P3：5′- CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′  EcoRI；

P4：5′- CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′    HindIII；

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下：

95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；63℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存；

再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；

⑵构建游离表达载体pXJM19- ksdD

将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19- ksdD，所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 μL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比为3:1~9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16 oC下，过夜反应；

经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。

2.如权利要求1所述的构建方法构建得到的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌的步骤如下：

将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取按感受态细胞：质料 μL：ng为1：3的比例加入质粒pXJM19- ksdD，混合均匀，使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为：15kV/cm，25 μF，电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基中，振荡培养7~9 h，复苏培养基连续稀释后取150μL涂布于含40 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，在抗性板上长出的菌落，即为高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的复苏培养基的配方如下：含有浓度为10-15 mg/mL山梨醇的LB培养基。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的简单节杆菌工程菌在一次性投料的生物转化方面中的应用。