[发明专利]能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及一种能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因（KsdD）的质粒。

技术背景

甾体类药物具有重要的生理活性，在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物。醋酸可的松位C1,2位上导入双键后成醋酸泼尼松，抗炎作用能够提高3-4倍，并且减少由钠滞留而带来的副作用。目前，甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种，化学方法进行C1,2位脱氢一般采用二氧化硒法，该方法常使产品中带有少量难以除尽对人体有害的硒，然而微生物转化法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。

简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)的C1,2位脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，也是采用发酵法工业生产甾类药物的典型代表。目前甾体微生物转化主要研究的领域主要在以下几个方面：提高水不溶性底物的溶解度，细胞和酶的固定化以利于酶的重复利用，发展经济有效的产物连续回收方式等用来提高产量。但是，寻找、筛选更优良菌种来提高转化率才是更加长期有效的方法。目前国内在这步反应中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上进行深入的探索，尚无基因工程菌研发成功。这也限制了国内甾体药物生产的进一步发展。随着分子生物学的发展和人们对甾体代谢机制研究的深入，基因工程在甾体药物生产中必将得到广泛的应用。

本发明所用的简单节杆菌是一种模式C1,2位脱氢微生物，由于其发酵工业背景清楚，操作技术成熟等特点，已经广泛用于醋酸可的松C1,2位脱氢等领域。Choi等（1995, Journal of bacteriology 1779（5），4152-4156）描述了简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)菌株中C1,2位脱氢基因（KsdD）的基因序列、成功的将此基因异源表达于链霉菌并研究了此酶的性质，但并未对简单节杆菌本身进行分子改造。简单节杆菌本身的遗传背景不清楚，没有相关的能在简单节杆菌中复制表达的质粒被报道。

通过检索，尚未发现与本专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种制备时环境温和、易于操作、生产成本低、能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法，具体步骤如下：

⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：

P3：5′- CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′  EcoRI；

P4：5′- CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′    HindIII；

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下：

95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；63℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存；

再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；

⑵构建游离表达载体pXJM19- ksdD

将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19- ksdD，所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 μL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比为3:1~9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16 oC下，过夜反应；

经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。

如上所述的构建方法构建得到的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。

而且，所述的构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌的步骤如下：