[发明专利]基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法

摘要

本发明公开了一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，按照如下步骤完成：（1）用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA；（2）用MseI完全消化步骤（1）所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，然后与接头引物等混合形成20μl的反应体系；（3）连接有接头的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA使用的接头引物和MITE特异性引物在25μl反应体系中进行扩增；（4）预扩增产物稀释20倍在第二轮PCR使用；（5）最终产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。本检测技术对家蚕微孢子虫的检测具有有效性强、特异性高、灵敏性高等特点，并且适用于小量样品操作，操作流程巧妙。

主权项

1.一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于，按照如下步骤完成：（1）、用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA；（2）、用MseI酶完全消化步骤（1）所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，并与接头引物混合连接，形成连接混液，具体反应为0.5ml离心管中加入下列反应物并且混合均匀：接头引物：5′-CAGGGTGGGCAAA-3′              SEQ NO 1；（3）、将步骤（2）所得的连接混液取1μl，在以下25μl反应体系中进行预扩增：A.在0.5ml离心管中加入以下反应物并且混合均匀：PCR反应扩增的引物：NbME5特异引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′          SEQ NO 2NbME1特异性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′          SEQ NO 3B.将步骤A所得的溶液通过离心后，按以下参数进行PCR扩增：（4）将步骤（3）所得的预扩增产物稀释20倍后，再进行第二轮PCR扩增的DNA模板，对稀释后的产物加入锚定引物和NbME特异性引物后，在20μL体系下进行扩增。反应体系如下：A.在0.5ml离心管仲加入下列反应物并且混合均匀NbME5特异引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′          SEQ NO 2NbME1特异性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′          SEQ NO 3锚定引物1：5′-CAGGGTGGGCAAACT-3′                 SEQ NO 4锚定引物2:5′-CAGGGTGGGCAAACA-3′                  SEQ NO 5B.将步骤A所得的溶液通过转速离心后,按下列参数进行梯度PCR扩增：1）、第一轮扩增参数：2)、循环步骤1)中的步骤b至步骤d，每轮循环退火温度递减0.7℃，扩增12轮；3）、继续按以下参数扩增23轮：（5）凝胶分析A.制备1%的琼脂糖凝胶；B.梯度PCR扩增产物与6×Loading buffer以8：2混合；C.上样10μL；D.220V电泳，溴酚兰至胶2/3处停止电泳；E.EB染色15-20min，观察结果。