[发明专利]猪附红细胞体PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种猪附红细胞体PCR检测方法，依次包括病原的分离纯化，猪附红细胞体DNA的提取，引物的设计与合成，普通PCR的检测，阳性质粒标准品的制备，实时荧光定量PCR的检测的步骤。相对于IHA、ELISA等其他检测方法而言，其特异性高、敏感性强，准确性可靠性大；能快速、简便、可靠、准确的检测出样品中的附红细胞体，也可用于附红细胞体病的流行病学调查和疗效检测。

主权项

一种猪附红细胞体PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样1ml，4℃或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗，2000r/min离心10min，去上清液，于沉淀中加入1倍的PBS稀释，56℃水浴3min，立即2000r/min离心10min，弃沉淀，取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4℃或－20℃保存备用；（2）猪附红细胞体DNA的提取，按Genomic DNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，４℃或－２０℃保存备用；（3）引物的设计与合成，根据GenBank中登录的猪附红细胞体１６ＳrRNA序列，用Primerpremier5.0 软件设计了１对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为：上游引物Ｐ１：５′＞ＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡ＜３′；下游引物Ｐ２：５′＞ＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣ＜３′；（4）普通PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为：10×PCR缓冲液2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA聚合酶Q 0.25ul，20pmol/ul上、下游引物P1、P2各0.5ul，模板DNA 2ul，加ddH₂O补足至25ul；反应条件为：95℃3min，94℃30s，56℃40ｓ，72℃30ｓ，30个循环，72℃延伸10min，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳；（5）阳性质粒标准品的制备，将普通PCR扩增产物纯化后连接到ｐＭＤ１８‑Ｔ载体上，然后转化于DH_５大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆子，并以此阳性质粒作为标准品，用于实时荧光定量PCR扩增；（６）实时荧光定量PCR的检测，反应体系为：10×PCR缓冲液2.5ul，2.5mmol/ul Mg²⁺0.2ul，Mg²⁺ 0.2ul，10mmol/ul dNTP 2ul，rTaq DNA聚合酶Q 0.25ul，20pmol/ul上、下游引物P1、P2各0.5ul，标准品DNA 2ul，SYBR GreenI 0.3ul，加ddH₂O补足至25ul；反应条件为：95℃3min，94℃30s，56℃40ｓ，72℃30ｓ，然后95℃1min，60℃1min，75℃时收集荧光信号，进行40个循环，每个循环升高0.5℃，停留８ｓ，做熔解曲线。