[发明专利]一种HIV-1耐药野生型基因合成方法

摘要

本发明提供了一种HIV-1耐药野生型基因合成方法,将长目的片段分段合成，并合成错位互补片段，通过运用多次PCR方法合成所需目的基因片段，这一方法既简单又安全，无需复杂的设备，也不需要一个高度管制的实验环境，尤其适用感染性疾病目的基因的研究。本发明的技术方案在功能基因组学等领域有着广泛的应用，比如，在突变，缺失或嵌合基因编码一个特定的蛋白质，具有很大的灵活性。

主权项

一种HIV‑1耐药野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：（1） 把HIV‑1耐药野生型基因,分成若干N段（n=20‑40）的A碱基片段,即 A1，A2，A3，A4，A5…An,并进行人工合成，设计并人工合成与上述片段互补的N‑1碱基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn‑1 ；其中，任一Bn碱基片段的5’端比各耐药野生型基因片段的An碱基片段5’端后移20‑25bp；Bn碱基片段的端延伸到耐药野生型基因片段的An+1碱基片段5’端20‑25bp，根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物；（2）将上述相互对应部分互补的碱基片段分别进行PCR扩增，即A1/B1, A2/B2, A3/B3…… An/Bn,由部分互补变为完全互补片段； （3）再将上述具有互补片段的相邻扩增产物，二次扩增；（4）以3个A碱基片段为单位分别合成167bp片段，并需要进行琼脂糖凝胶的割胶回收纯化，标记为C1，C2，C4，C5…Cn/3, 最后一个An片段可与Cn/3连接；（5）再运用PCR分别两两扩增C1和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和C10各可得到309bp片段，标记为D1，D2，D3，D4，D5；（6）再运用PCR分别两两扩增D1和D2，D3和D4可得598bp片段，标记为E1，E2，D5跟E2连接可得F1=887bp；（7）最后将E1和F1进行PCR连接就可以得到1508bp的片段；（8）将片段插入TA载体中，并鉴定野生型模板是否构建正确。