[发明专利]一种HIV-1耐药野生型基因合成方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HIV-1耐药野生型基因合成方法及引物。

背景技术

基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成有所不同：寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段仅为100nt左右，而基因合成则为双链DNA分子合成，所能合成的长度范围50bp-12 kb。 

基因合成是用人工方法合成基因的技术，是基因获取的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制。人类首条人工合成的基因出现在上世纪60年代基因合成是当前合成生物学的主要内容，通过基因合成，可以获得自然界中不存在的基因，为人类改造生物开辟了一个全新的方向，在可预计的将来，基因合成将在生命科学领域发挥巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物医药[1]等领域的作用已初步体现。基因合成也存在潜在的被开发成生物武器的可能，而这个可能性在几个病毒的人工合成之后变得更加突出。 

目前基因合成有两种途径，一是向基因合成公司订制，二是作本地基因合成。由于基因合成技术还没有一个统一的方法，基因合成的技能和经验在合成过程中具有决定性的影响，所以大部分基因合成都是在专业人员手中完成的，这也决定了途径一是目前的主要渠道。本地基因合成一般需要参考学术文章，这方面的文章有很多，如【Neves FO, Ho PL, Raw I, Pereira CA, Moreira C, Nascimento AL. Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli. Protein Expr Purif. Jun;35(2):353-9(2004)】。但大多只是个别基因的合成，只具备有限的参考价值，除非是那些为了研究技术本身而作的基因合成。HIV-1因其为RNA病毒，具有高突变特性。HIV病毒基因突变使药物作用靶点结构发生改变，导致病毒对药物不敏感或敏感性下降。因各种类型HIV耐药相关的基因突变不断发生，因此如何准确测定耐药基因尤为重要。而一般的分子实验室因条件及级别的限定，都是不能直接做艾滋病毒的实验，换而言之，就无法直接从艾滋病毒中获得药物作用的靶点基因，只能通过实验室人工合成耐药突变模板，进行下一步的实验。大部分的实验室主要是通过公司来合成较长的目的片段，因此，需要一种可以在实验室方法来合成想要的片段。

发明内容

本发明所要解决的第一方面的问题在于克服现有技术中HIV-1耐药野生型基因合成困难的问题，提供一种步骤简单、快速、准确、成本低的HIV-1耐药野生型基因合成方法及引物。

为了解决上述的第一方面的技术问题，本发明提供的技术方案为：一种HIV-1耐药野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1） 把HIV-1耐药野生型基因,分成若干N段（n=20-40）的A碱基片段,即 A1，A2，A3，A4，A5…An,并进行人工合成；

设计并人工合成与上述片段互补的N-1碱基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-1 ；其中，任一Bn碱基片段的5’端比各耐药野生型基因片段的An碱基片段5’端后移20-25bp；Bn碱基片段的端延伸到耐药野生型基因片段的An+1碱基片段5’端20-25bp；

根据上述相互匹配的两两对应互补片段设计并合成正向、反向引物；

（2）将上述相互对应部分互补的碱基片段分别进行PCR扩增，即A1/B1, A2/B2, A3/B3…… An/Bn,使部分互补经PCR扩增后变为完全互补； 

（3）再将上述具有互补片段的相邻扩增产物，二次扩增；

（4）以3个A碱基片段为单位分别合成167bp片段，并需要进行琼脂糖凝胶的割胶回收纯化，标记为C1，C2，C4，C5…Cn/3, 最后一个An片段可与Cn/3连接；

（5）再运用PCR分别两两扩增C1和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和C10各可得到309bp片段，标记为D1，D2，D3，D4，D5；

（6）再运用PCR分别两两扩增D1和D2，D3和D4可得598bp片段，标记为E1，E2，D5跟E2连接可得F1887bp；