[发明专利]口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用

摘要

本发明涉及一种口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的口蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。本发明中构建的嵌合病毒既保留了经典疫苗毒株细胞适应性良好的优点，又能通过插入流行毒株的结构蛋白克服抗原匹配性不高的缺点，可快速拯救病毒进行口蹄疫灭活疫苗的生产；以本载体构建的A型或Asia Ⅰ型或O型不同毒株嵌合病毒为弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了L蛋白，在自然条件下不发生毒力返强，并且病毒对乳鼠、猪或牛的致病力大大降低或者无致病性。安全性高，不会引起口蹄疫疫情的发生，非常具有实用价值。

主权项

口蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤：（1）口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以口蹄疫病毒CHA90全长感染性克隆为基础，使用序列1和序列2所述一对引物及序列4和序列5所述一对引物通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物（序列7）克隆至pMD18‑T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba Ⅰ/Not Ⅰ酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为p43‑CHA90‑LL；（2）结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述一对引物及序列10和序列11通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白P1大部分基因（VP2、VP3、VP1），同时通过同义突变引入酶切位点Ssp Ⅰ、SgrA Ⅰ，将PCR产物克隆至pMD18‑T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn Ⅰ酶切连接至（1）项构建的p43‑CHA90‑LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43‑CHA90‑LL‑Vector，该重组载体p43‑CHA90‑LL‑Vector已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43‑CHA90‑LL‑Vector的大肠埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.6898。