[发明专利]口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用

权利要求书

1.口蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤：

（1）口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以口蹄疫病毒CHA90全长感染性克隆为基础，使用序列1和序列2所述一对引物及序列4和序列5所述一对引物通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物（序列7）克隆至pMD18-T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba Ⅰ/Not Ⅰ酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为p43-CHA90-LL；

（2）结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述一对引物及序列10和序列11通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白P1大部分基因（VP2、VP3、VP1），同时通过同义突变引入酶切位点Ssp Ⅰ、SgrA Ⅰ，将PCR产物克隆至pMD18-T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn Ⅰ酶切连接至（1）项构建的p43-CHA90-LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43-CHA90-LL-Vector，该重组载体p43-CHA90-LL-Vector已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43-CHA90-LL-Vector的大肠埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.6898。

2.如权利要求1中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于；（1）含口蹄疫病毒流行株病毒结构蛋白基因的感染性克隆构建；（2）含口蹄疫流行毒株结构蛋白的嵌合病毒拯救，及病毒繁殖；（3）疫苗制备。

3.如权利要求2中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于含口蹄疫病毒流行株病毒结构蛋白基因的感染性克隆构建，其构建是通过PCR扩增口蹄疫病毒不同流行株病毒的相应结构蛋白部分的DNA序列，插入到重组载体p43-CHA90-LL-Vector，通过病毒拯救，构建了分别含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的口蹄疫嵌合病毒。

4.如权利要求2中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于口蹄疫嵌合病毒的拯救，是含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的嵌合病毒感染性克隆质粒体外转录制备成RNA或直接将质粒DNA与T7聚合酶表达质粒，通过脂质体转染或电转染BHK-21细胞，成功拯救出病毒。

5.如权利要求4中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于将缺失L蛋白或结构蛋白或两者均缺失的口蹄疫病毒基础上构建获得的包含O型、Asia I型或A型不同毒株的嵌合病毒通过转瓶培养或悬浮培养大量繁殖病毒，用于口蹄疫疫苗生产，制备相应型毒株的灭活疫苗，其灭活疫苗的制备方法为将口蹄疫嵌合病毒接种生长良好的BHK-21细胞，待细胞病变达90%以上时收获病毒，经灭活、纯化、浓缩处理后，加入油佐剂（如Mantanide ISA206）乳化而成。