[发明专利]一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法

摘要

本发明阐述了一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，即以研究室保藏产硫酸软骨素菌株为生产菌株，在7L罐中发酵后收集发酵液，将发酵液进行预处理，然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除发酵液中的蛋白质等杂质，再利用超滤离心管反复三次离心除去发酵液中的小分子物质，最后将浓缩液真空冷冻干燥48h得到硫酸软骨素纯品。本发明经过浓缩后大大节约了使用乙醇的量，氯仿可以回收利用，同时使用超滤离心管对于小量制备硫酸软骨素纯品更加快捷、方便。

主权项

一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤：1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K2HPO4·3H2O 0.04％，KH2PO40.04％。发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH4)2SO40.2％，K2HPO40.15％，KH2PO4·3H2O 0.15％，MgSO4·7H2O 0.04％，MnCl2·4H2O 0.02％。2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，再用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；3)取上清液，加入上清体积2‑3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7‑1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2‑3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2‑3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；5)去提纯样品适量于超滤离心管中，超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂，浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质，浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。