[发明专利]一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法

权利要求书

1.一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤：

1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。

种子培养基：

葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄0.04％。

发酵培养基：

葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH₄)₂SO₄0.2％，K₂HPO₄0.15％，KH₂PO₄·3H₂O 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，MnCl₂·4H₂O 0.02％。

2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，再用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；

3)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；

4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；

5)去提纯样品适量于超滤离心管中，超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂，浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质，浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。

2.根据权利要求1所述一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征是：步骤2)中旋转蒸发温度为45℃，蒸发至原体积的三分之一；步骤5)中超滤离心管的截留分子量为10kDa，转速为5000rpm，浓缩至原体积的十分之一；步骤5)中浓缩液冷冻条件为-70℃中5-6h，然后再真空度2.5Pa下冷冻干燥48h得硫酸软骨素纯品。