[发明专利]一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法

说明书

技术领域

一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域，特别是从发酵液中而非动物中提取硫酸软骨素。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种酸性的黏多糖，其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键相连，糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化，如图1。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。

CS是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，其作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素具有以下生物活性：镇痛抗炎作用；促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用；抗粘连作用；免疫调节作用；调血脂、抗动脉粥样硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用。CS还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。

现今硫酸软骨素工业生产方法是从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取，主要使用酶法和碱法相结合的方法，但是该方法存在收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。发酵法生产CS不受原材料限制，成本低、环境友好，但是尚处于初级阶段，国内使用发酵法生产硫酸软骨素尚属空白，国外有发酵液中小量制备硫酸软骨素类似物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵液中提取硫酸软骨的方法，该提取方法具有回收率高、提取简单、环境友好等优点。

本发明的技术方案：

1、发酵液的制备

取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养温度为37℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，培养温度为37℃，装液量为3L/7L，转速为400rpm，通气量为1.7L/min，发酵周期为24h。

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室选育，主要用来生产硫酸软骨素，该菌株已申请中国专利，并且进入实质性审查，申请号为201110127831.1。

种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄0.04％。

发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH₄)₂SO₄0.2％，K₂HPO₄0.15％，KH₂PO₄·3H₂O0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，MnCl₂·4H₂O 0.02％。

2、发酵液中样品分离纯化

1)取发酵液在旋转蒸发仪中45℃进行浓缩，将发酵液体积浓缩至原来的三分之。用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；

2)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；

3)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；