[发明专利]一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法

摘要

本发明涉及一种利用实时荧光定量PCR技术对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，属于环境微生物生态学领域。所述方法包括：沉积物样品DNA的提取和定量，肼氧化还原酶HZO基因特异性引物的PCR扩增，标准质粒的构建，荧光定量PCR扩增和标准曲线的制作。根据检测到的样品Ct值对照标准曲线计算样品中厌氧氨氧化细菌的数量，得到的初始模板基因拷贝数的对数值与Ct值有较好的线性关系，回归系数大于0.99。本发明使用肼氧化还原酶HZO基因对厌氧条件下的氨氧化细菌进行定量分析，克服了现有方法使用16S rRNA基因进行定量的特异性不强、覆盖率低、不准确等缺点，提供了一种高特异性、快速、准确的检测水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌数量的方法。

主权项

一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，其特征在于，通过肼氧化还原酶HZO基因的荧光定量PCR反应，对厌氧氨氧化细菌进行定量，步骤为：（1）样品DNA的提取和定量取沉积物样品，加入裂解液，在核酸提取仪中进行裂解，裂解后的样品冷冻离心取上清液，调整盐离子浓度后加入硅胶颗粒，使DNA结合在硅胶颗粒上，结合DNA的硅胶颗粒悬浮液转移入纯化柱，清洗去除蛋白质等杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在硅胶颗粒上的宏基因组DNA，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验DNA的浓度和纯度。用荧光定量仪测定宏基因组DNA浓度；（2）HZO基因标准质粒的制作使用HZO基因特异性引物hzoF1和hzoR1对样品DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×PCR Buffer1.25μl，2.5mM dNTP 1.00μl，25mM MgCl20.75μl，10μg/μlBSA 1.00μl，20μM的hzoF1和hzoR1引物各0.25μl，沉积物总DNA 1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，双蒸水补足到25μl，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，合并多次反应得到的PCR产物，切胶回收后连接入pGMT‑19Simple Vector载体中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，液体LB培养基过夜培养，提取质粒，测定浓度后将质粒10倍浓度梯度稀释，制作标准品，用荧光定量仪测定质粒浓度，计算基因拷贝数；（3）荧光定量PCR扩增调整所有样品DNA的浓度至10μg/μl，对标准质粒和样品在同一批次进行荧光定量PCR扩增。反应体系包括：2×SYBR Green Premix 7.5μl，10μM上下游引物各0.3μl，50×ROXReference Dye II 0.3μl，模板DNA1.0μl，双蒸水补足到总体积12.5μl，PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性；（4）沉积物样品厌氧氨氧化细菌数量计算根据标准质粒的初始拷贝数的对数值和Ct值制作标准曲线，得到回归曲线和公式，根据定量PCR反应得到的样品Ct值，计算出HZO基因的拷贝数。