[发明专利]一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，属于环境微生物生态学技术领域。

背景技术

我国是第一水产养殖大国和水产品贸易大国，养殖水产品产量占全世界产量的70%。集约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投饵造成养殖水体中积累大量的粪便、残饵和死亡的动植物尸体，导致水体中作为蛋白代谢终产物的氨氮和亚硝酸氮含量严重超标，养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，造成巨大的经济损失。同时，大量养殖含氮废水排放到沿海海域，造成了严重的环境污染，引发附近海域富营养化现象。氨氮污染已成为制约水产养殖成败和环境污染的主要胁迫因子，控制水体中的氨氮污染成为规模化养殖成功的关键之一。

氨氮的去除主要通过氨氧化作用进行，氨氧化微生物能够快速降解、吸收和转化水中的氮素污染物，并在形成优势菌群后抑制有害微生物的生长，在养殖水体修复、自净中发挥关键性作用。水产养殖环境的底泥（即沉积物）中有大量的微生物群落，它们参与氮、磷等多种营养素的生物地球化学循环，它们与水体中的微生物快速交换，对维持沉积物和水体的生态平衡有重要意义。长期以来，氨氧化被认为是一个好氧过程，由氨氧化细菌（AOB，ammoniaoxidizing bacteria）和氨氧化古菌（AOA，ammonia oxidizing archaea）参与。最近的研究发现，厌氧氨氧化（Anammox，anearobic ammonia oxidizing）过程能够在缺氧和厌氧条件下将氨氮和亚硝酸氮转化为氮气，广泛分布与海洋、淡水、土壤等生态系统。在缺氧的海洋沉积物中，厌氧氨氧化过程产生的氮气的比例占据到20-79%，是不可忽视的重要生物地球化学循环过程。水产养殖环境经常处于缺氧状态，厌氧氨氧化过程不但能够去除氨氮，同时还能够解除亚硝酸盐的毒性作用，对维持水产养殖环境中沉积物和水体的良好条件有重要意义。

厌氧氨氧化过程由隶属于浮霉菌门的厌氧氨氧化细菌执行。厌氧氨氧化细菌生长十分缓慢（平均传代时间10-12天），且与其它微生物之间存在复杂的竞争和共生关系，至今在世界范围内尚未得到厌氧氨氧化细菌的纯培养菌株。这极大地限制了传统的生理生化方法对厌氧氨氧化细菌的研究，迫切需要一种新的方法对厌氧氨氧化细菌的存在、种群、数量和生态学特点进行揭示。荧光定量PCR技术是最近发展出来的分子生物学手段，是在PCR技术的基础上发展而来的一种体外定量手段，已广泛应用于微生物学研究，可以不依赖于纯培养手段对微生物进行种类和数量的检测。

现有的厌氧氨氧化细菌的分子生物学研究多使用16S rRNA基因作为分子标识，如沈李东，胡宝兰等人对西湖底泥中厌氧氨氧化菌进行的分子生物学检测（沈李东，胡宝兰，郑平，钱轶超，陈婷婷，胡安辉，楼莉萍，《西湖底泥中厌氧氨氧化菌的分子生物学检测》，环境生物学报，2011:31（8）：1609-1615）以及叶磊，祝贵兵等人对北京某污水处理厂的活性污泥进行的分子生物学检测（叶磊，祝贵兵，伦中财，王朝旭，王衫允，冯晓娟，尹澄清，《应用分子生物学与同位素示踪技术研究厌氧氨氧化菌活性及功效》，环境科学学报，31（6）：1206-1211），上述检测都是针对厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因设计了特异性引物。但是，16SrRNA引物存在特异性不强、覆盖率不够、多样性偏低、有非目的基因扩增等缺点，不能够真实的反映环境中存在的厌氧氨氧化细菌的种类、多样性、分布和数量。本发明使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性引物，利用实时荧光定量PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，能够克服已有技术的缺点，快速、灵敏、准确、真实地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

发明内容

肼氧化还原酶HZO（Hydrazine oxydoreductase）负责催化厌氧氨氧化反应的关键步骤，目前仅仅在厌氧氨氧化细菌这一类群中发现HZO酶的存在，是厌氧氨氧化细菌的特征酶。本发明的发明人使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性引物，利用荧光定量PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，可以克服已有16S rRNA基因测定特异性不高、多样性偏低、存在假阳性扩增的缺点，能够快速、灵敏、准确、真实地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

本发明的目的是，克服厌氧氨氧化细菌无法纯化培养和16S rRNA基因定量不准确的缺陷，使用对应厌氧氨氧化关键功能酶HZO基因的特异性引物，利用实时荧光定量PCR技术，实现水产养殖沉积物中的厌氧氨氧化细菌快速、灵敏、准确、真实的定量研究。