[发明专利]一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法

摘要

本发明涉及一种窖泥微生物群落的分析方法，尤其是浓香型白酒窖泥古菌群落及多样性特征的分析方法。具体方法如下：1）称取一定量的窖泥，加入PBS缓冲液及硫酸铝溶液进行预处理；2）加入DNA提取缓冲液、溶菌酶、消化肽酶等多酶体系进行细胞破壁处理；3）加入氯仿-酚抽提除杂；4）异丙醇沉淀，得到样品基因组DNA；5）以古菌基因组DNA为模版，进行巢式PCR-DGGE分析。本发明在DNA提取前为窖泥微生物提供了PBS缓冲体系，加入的硫酸铝能高效去除腐殖质；有针对性地加入能有效裂解古菌细胞壁的消化肽酶，达到了提高基因组DNA质量及纯度的目的；结合巢式PCR-DGGE指纹图谱技术得到了较真实、可靠的酿酒窖池古菌群落多样性信息，为准确剖析浓香型白酒窖池古菌群落随窖龄变迁的规律提供了准确、快速的分析手段。

主权项

一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤：1）样品预处理：①称取5g样品，加入20mL无菌PBS，充分混匀，加入5mL 0.1mol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀后800r/min离心，收集上清液；②重复洗涤沉淀并合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量0.1mol/L硫酸铝溶液，10000r/min离心10min，弃上清液。2）基因组DNA提取：①将1）所得沉淀溶解于500μLDNA提取缓冲液（0.1M Tris‑HCl，0.1M EDTA，1.5M NaCl，1%CTAB，pH8.0），加入溶菌酶（100mg/mL）、纤维素酶（200mg/mL）、蜗牛酶（100mg/mL）及消化肽酶（250U/mL） 各20μL，37℃水浴2h；②向上述样品中加入20% SDS 25μL，65℃保温1.5h；③向上述样品中加入10μL蛋白酶K（250mg/mL），55℃水浴1h， 5000r/min离心4min，转移上清液；④向上述上清液中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；⑤向上述上清液中加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；⑥向上述上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇，‑20℃下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤1~2次后吹干；⑦将DNA溶解于50~100μL TE中，‑20℃保存。3）PCR扩增                  PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50uL：25uL Taq酶反应体系混合液，引物PRA46f/PREA1100r （10umol/L）各2uL，模板2uL，ddH2O补足50uL；第二轮扩增体系为50uL：25uL Taq酶反应体系混合液，引物PARCH340f‑GC/PARCH519r（10umol/L）各2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH2O补足50uL。扩增条件为92℃预变性2min，92℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸6min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。DGGE变性剂浓度梯度为35%~65%，1×TAE电泳缓冲液，60℃，130V，电泳5h后SYBR Green I立即染色。