[发明专利]一种烧骨DNA的检测方法

摘要

本发明公开了法医学技术领域一种烧骨DNA检测方法，具体操作步骤包括：取烧骨检材，生物冷冻研磨，EDTA脱钙，改良酚－氯仿提取DNA，ND-1000光度计检测DNA浓度和纯度；5色荧光标记，PCR复合扩增，基因分析仪毛细管电泳，GeneMapper软件对DNA基因位点收集数据和分析。该方法能对烧骨DNA进行有效提取和检测，用于涉骨案件或事故中烧骨的个人识别、亲权鉴定和同一认定。

主权项

一种烧骨DNA的检测方法，其特征在于按下述步骤操作：a. 烧骨DNA的提取和纯化（1）样本机械粉碎后置于生物冷冻研磨机研磨，预冷15min，研磨2次，每次研磨10min；（2）取骨粉2.0g,由8‑10ml的乙二胺四乙酸二钠对骨粉脱钙，50℃水浴脱钙2～3d，脱钙2～3次；（3）加入裂解液，所述裂解液由20mg/ml的蛋白酶K 20μl, 1mmol/l的二硫苏糖醇20μl和4%的十二烷基硫酸酯钠 250μl混匀配制而成，置于50℃水浴8～12h，追加裂解液2～3次，静置10h，冷冻离心，取上液；（4）加入饱和酚450μl和体积比24：1的三氯甲烷、异戊醇混合液100μl，混匀，离心后取上液，再加入体积比24：1的三氯甲烷、异戊醇混合液600μl，混匀，离心后取上液；（5）加入正丁醇600μl，混匀，离心后弃上液,乙醚600μl，混匀，离心后弃上液，置于50℃，数分钟，挥发完全；（6）加入Buffer PB 5ml、RNA 1μl，冷冻离心后取上液，通过硅膜管，每次约700μl，离心数次，弃下液，用磷酸盐缓冲液700μl洗一次；（7）加入Buffer PE洗液1ml，混匀，离心重复2～3次，离心转速8000r/min，离心时间8min；（8）将步骤7的离心后底物，加入已有30μl溴化乙锭EB试管中， 置于52℃水浴5min，再冷冻离心，转速13000r/min，离心时间8min；b.吸取DNA样品，ND‑1000光度计检测DNA含量，分别测定在260nm和280nm处的吸光度，读取DNA样品浓度和纯度；c. PCR复合扩增配制PCR反应体系，反应体系经预变性、变性、退火、延伸30个循环反应，25℃保存；d.自动基因分析仪进行扩增产物的检测PCR产物经变性、冰浴后，加入遗传分析仪96孔反应板的反应孔内，启动基因分析仪，进行毛细管电泳，电泳信息由数据收集软件自动收集，电泳结束后，GeneMapper分析软件把收集的电泳图谱信息经计算机处理成数据信息，与等位基因分子内标比对。