[发明专利]一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法

摘要

本发明提供了一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法，属于抗体库及其制备领域；本发明为取多药耐药性大肠癌病理组织，注射BALB/C成年小鼠，检测抗体滴度大于1:512时，处死小鼠取脾组织，提取脾组织总RNA并逆转录为cDNA；以此为模板，设计17条重链上游引物和5条重链下游引物；20条轻链上游引物及2条轻链下游引物,PCR扩增出重链Fd段及轻链κ和λ链,依次克隆入pComb3载体并转化至E.coliXL1-Blue中，成功构建库容为2.47×106CFU的抗P-gpFab免疫抗体，重链Fd段平均插入率为80%，轻链平均插入率为90%，Fab插入率为72%。

主权项

一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库，其特征在于：(1)取多药耐药性大肠癌病理组织，匀浆后免疫小鼠，抗体滴度大于1:512，提取总RNA并逆转录为cDNA；(2)设计17条重链上游引物，见SEQ ID NO：1‑17和5条重链下游引物，见SEQ ID NO：18‑22及20条轻链上游引物，见SEQ ID NO：,23‑42及2条轻链下游引物见SEQ ID NO：43,44，其中重链5′引物引入XhoⅠ酶切位点，3′引物引入SpeⅠ酶切位点，轻链5′引物引入SacⅠ酶切位点，3′引物引入XbaⅠ酶切位点；(3)PCR扩增小鼠IgG重链及轻链基因片段；(4)重链Fd库的建立：将载体pComb3质粒与重链Fd段扩增产物分别进行XhoⅠ、SpeⅠ双酶切后连接，连接产物热激转化XL1‑blue感受态细胞，得重链Fd库，多次转化后使Fd库的克隆数达到105以上，并提取重链Fd‑pComb3库质粒；(5)轻链T‑L库的建立：将轻链扩增产物与T载体连接，将连接产物热激转化TOP10感受态细胞，得到轻链T‑L库，多次转化后使T‑L克隆数达到105以上，并提取轻链T‑L库质粒；(6)抗体库的建立：将重链Fd‑pComb3库质粒与轻链T‑L库质粒分别进行XbaⅠ、SacⅠ双酶切，凝胶回收，将Fd‑pComb3与L连接，连接产物热激转化至XL1‑blue感受态细胞，多次转化后得到Fab抗体库， Fab抗体库容量达到106克隆以上。