[发明专利]一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法无效
| 申请号： | 201210352439.1 | 申请日： | 2012-09-21 |
| 公开（公告）号： | CN102888658A | 公开（公告）日： | 2013-01-23 |
| 发明（设计）人： | 张学梅;梁文波;曹阳;张海玉;王清 | 申请（专利权）人： | 大连大学 |
| 主分类号： | C40B40/10 | 分类号： | C40B40/10;C12N15/13;C12N15/63;C07K16/30 |
| 代理公司： | 大连智慧专利事务所 21215 | 代理人： | 周志舰 |
| 地址： | 116622 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 鼠源抗 人大 肠癌 fab 噬菌体 抗体 及其 构建 方法 | ||
1.一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库，其特征在于：
(1)取多药耐药性大肠癌病理组织，匀浆后免疫小鼠，抗体滴度大于1:512，提取总RNA并逆转录为cDNA；
(2)设计17条重链上游引物，见SEQ ID NO：1-17和5条重链下游引物，见SEQ ID NO：18-22及20条轻链上游引物，见SEQ ID NO：,23-42及2条轻链下游引物见SEQ ID NO：43,44，其中重链5′引物引入XhoⅠ酶切位点，3′引物引入SpeⅠ酶切位点，轻链5′引物引入SacⅠ酶切位点，3′引物引入XbaⅠ酶切位点；
(3)PCR扩增小鼠IgG重链及轻链基因片段；
(4)重链Fd库的建立：将载体pComb3质粒与重链Fd段扩增产物分别进行XhoⅠ、SpeⅠ双酶切后连接，连接产物热激转化XL1-blue感受态细胞，得重链Fd库，多次转化后使Fd库的克隆数达到105以上，并提取重链Fd-pComb3库质粒；
(5)轻链T-L库的建立：将轻链扩增产物与T载体连接，将连接产物热激转化TOP10感受态细胞，得到轻链T-L库，多次转化后使T-L克隆数达到105以上，并提取轻链T-L库质粒；
(6)抗体库的建立：将重链Fd-pComb3库质粒与轻链T-L库质粒分别进行XbaⅠ、SacⅠ双酶切，凝胶回收，将Fd-pComb3与L连接，连接产物热激转化至XL1-blue感受态细胞，多次转化后得到Fab抗体库， Fab抗体库容量达到106克隆以上。
2.一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于：
(1)取多药耐药性大肠癌病理组织，匀浆后免疫小鼠，抗体滴度大于1:512，提取总RNA并逆转录为cDNA；
(2) 设计17条重链上游引物，见SEQ ID NO：1-17和5条重链下游引物，见SEQ ID NO：18-22及20条轻链上游引物，见SEQ ID NO：,23-42及2条轻链下游引物见SEQ ID NO：43,44，其中重链5′引物引入XhoⅠ酶切位点，3′引物引入SpeⅠ酶切位点，轻链5′引物引入SacⅠ酶切位点，3′引物引入XbaⅠ酶切位点；
(3)PCR扩增小鼠IgG重链及轻链基因片段；
(4)重链Fd库的建立：将载体pComb3质粒与重链Fd段扩增产物分别进行XhoⅠ、SpeⅠ双酶切后连接，连接产物热激转化XL1-blue感受态细胞，得重链Fd库，多次转化后使Fd库的克隆数达到105以上，并提取重链Fd-pComb3库质粒；
(5)轻链T-L库的建立：将轻链扩增产物与T载体连接，将连接产物热激转化TOP10感受态细胞，得到轻链T-L库，多次转化后使T-L克隆数达到105以上，并提取轻链T-L库质粒；
(6)抗体库的建立：将重链Fd-pComb3库质粒与轻链T-L库质粒分别进行XbaⅠ、SacⅠ双酶切，凝胶回收，将Fd-pComb3与L连接，连接产物热激转化至XL1-blue感受态细胞，多次转化后得到Fab抗体库， Fab抗体库容量达到106克隆以上。
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