[发明专利]一种鼠源抗人大肠癌Fab噬菌体抗体库及其构建方法

说明书

技术领域

     本发明属于抗体库及其制备领域，特别涉及一种小鼠抗人大肠癌Fab抗体库的构建方 

法。

背景技术

肿瘤细胞的多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）多为获得性耐药，即在治疗前对药物敏感，治疗后对药物耐受。多药耐药性是指不仅对使用药物产生耐受，而且对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐受。肿瘤细胞产生多药耐药性的最主要原因是瘤细胞膜过量表达一种ATP依赖性外排性泵，以减少化疗药物在细胞内部的积累。这种ATP依赖性外排泵属于ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白超家族，主要包括以下几种：⑴肿瘤多药耐药蛋白1/P-糖蛋白即为P-gp（Multi-Drug Resistance1/ P-glycoprotein，MDR1/P-gp）也称为ABCB1（ATP-binding cassette B1），它是1976年Juliano等在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现的，随后Roninson等获得人耐药KB癌细胞株的MDR1基因序列^[1]，P-gp也是现在引起肿瘤多药耐药性最常见的原因。⑵多药耐药相关蛋白⑶乳癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein，BCRP）⑷肺耐药相关蛋白（Lung resistance related protein，LRP）。 

P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药性的最主要原因，由多药耐药蛋白基因1（multi-drug resistance1，mdr1）编码为两个完全相同的单体组成，每个单体含有一个七次跨膜疏水区和一个ATP结合区，两个单体组合成一个能量依赖性泵位于细胞膜上。P-gp在分解ATP供给能量的同时，可以将肿瘤细胞内部的亲脂性化学药物排到细胞外，因此一些亲脂性药物可以竞争性抑制P-gp外排化疗药物的功能。P-gp诱导的多药耐药肿瘤中同时检测到高水平的蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC），PKC主要通过磷酸化P-gp药物结合位点的丝氨酸而增强其外排化疗药物的功能。 

第一代P-gp抑制剂为亲脂性化合物，如维拉帕米、奎尼丁、环孢素A等，可作为P-gp底物，与化疗药物竞争性或非竞争性结合P-gp，从而减少化疗药物外排。但是当它们的应用剂量达到抑制P-gp功能时有很强的毒副作用，这也限制了它们的临床应用。接着第二代P-gp抑制剂出现，如PSC-833（环孢素D衍生物）和Biricodar，它们与P-gp的亲和力更强，并且没有免疫抑制副作用；但是它们缺乏特异性，同样抑制正常组织P-gp功能，而且还抑制细胞色素P450 3A的功能进而影响药物代谢，因此它们的研发也受到限制。于是以tariquidar、OC144-093、zosuquidar、elacridar为代表的第三代P-gp抑制药物应运而生，它们对P-gp亲和力高，而且对依赖细胞色素P450 3A的药物代谢影响很小，然而它们在达到抑制P-gp功能剂量时，仍有一定的细胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代P-gp抑制药物还处于临床试验阶段。 

    临床肿瘤出现多药耐药性多与P-gp有关，它已成为肿瘤化疗的最主要障碍之一。通过竞争性或非竞争性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表达是逆转肿瘤多药耐药性的主要手段，随着分子生物学技术的飞速发展，制备一种更特异的逆转肿瘤多药耐药性的药物，在保证化疗药物抑制肿瘤组织生长的同时对机体正常生理代谢的影响降到最低，成为可能，但是，目前还没有抗P-gp单克隆抗体作为抑制肿瘤多药耐药的药物。单克隆抗体用于抑制肿瘤多药耐药性有很多优点如可以特异性的结合P-gp抗原表位，不会影响细胞色素P450 3A依赖的药物代谢，小分子人源抗体在逆转肿瘤多药耐药中，既不会引起机体变态性免疫反应，又因为分子量小在体内代谢快，对正常组织细胞影响小，有助于耐药瘤细胞的化疗等。 

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌体结构基因的适当位置，并与结构基因融合表达于噬菌体外膜表面。现在噬菌体展示系统有多种，如丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等。