[发明专利]一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法

摘要

本发明提供了一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，以太湖蓝藻为氮源，以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶，发酵制备的蛋白酶最高酶活可达1200U/ml以上，所制备的蛋白酶在有机溶剂中保持着相当高的活性，如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮和甲醇中，其相对活性均在90％以上，既大幅降低了耐有机溶剂蛋白酶的生产成本，又治理了环境污染，变废为宝，且所制备的蛋白酶可广泛应用于洗涤剂、丝绸、造纸、制革与脱毛、环境修复与保护等领域，属于生物技术领域。

主权项

一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，以太湖蓝藻为氮源，以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶，工艺为：(1)种子培养种子培养基：牛肉膏5g/L，鱼蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2；取250ml的三角瓶若干个，每个装种子培养基50ml，121℃灭菌30分钟，冷却；在每个装种子培养基50ml的三角瓶中挑取一环菌接入，置于摇床培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，培养10小时即为发酵种子液；(2)产酶培养产酶培养基：蓝藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸锌0.15g/L，初始PH＝7.0，泡敌1.5ml/L；注：蓝藻先65℃烘干。取产酶培养基5升加入到7升发酵罐中，121℃灭菌40分钟，冷却；按6％的接种量，将300ml发酵种子液加入到含产酶培养基的发酵罐中，设定发酵参数，，温度30℃，pH 7.0，转速200r/min，通气量1.5，L/min/L，发酵20小时；(3)脂肪酶液制备将发酵液用高速冷冻离心机在4℃10,800g离心10min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液，工业大生产可用板框滤机压滤替代离心机离心；(4)脂肪酶活力的测定酶活力单位定义：1个酶活力单位U为在以下条件下1min释放1μg酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；取粗酶液100μg，加入偶联酪蛋白溶于pH＝7.8的50mM Tris‑HCl缓冲液且浓度为10g/L的偶联酪蛋白溶液500μg混匀，37℃反应10min，再加入浓度为100g/L的三氯乙酸1.9ml终止反应，反应混合液在10080×g转速下离心15min，小心吸取上清液，加入浓度为40g/L的NaOH 2ml显色，在440nm下比色，并记录吸光度，计算相应的酪氨酸含量，空白对照以水代替酶液进行测定。