[发明专利]一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法

摘要

一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，新型分裂锁式探针长约90bp左右，包括4个部分，即检测臂、通用引物区、的HhaI内切酶位点、标签序列区；其扩增系统由连接体系和RCA体系两部分组成，具体检测方法为，首先进行连接反应：将靶序列DNA片段与终浓度为1mol/L的四种分裂锁式探针混合，煮沸变性后杂交15min，加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液，补足10uL反应体系，37℃，45min，exonucleaseI和exonuclease III外切，制备出环状模板，然后RCA反应：将10μL连接产物和通用引物混合煮沸变性后，分别加入dNTP，phi29DNA聚合酶和HhaI限制性内切酶和缓冲液，共20μL反应体系，置于37℃，60min；最后对携带特异性标签序列的RCA单链DNA产物检测，根据结果得出相应的实验结论。

主权项

一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于：具体操作步骤为：步骤一、连接反应：将靶序列DNA片段与终浓度为0.1μmol/L的四种分裂锁式探针混合煮沸变性后，立即置于冰上冷却5min，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，连接反应时间：45min，再加入10U exonuclease I和10Uexonuclease III，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris‑HCL,10mmol/L MgCL2,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；步骤二、滚环扩增反应反应：取步骤一制得的混合连接产物10μL，与通用引物，其碱基序列如序列表序列10，混合煮沸变性后，分别加入摩尔浓度为的10mmol/LdNTP2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性内切酶10U和由33mmol/Ltris‑Ac、10mmol/LMgAC2、6mmol/LKAC和0.1μg/μLBSA组成的缓冲液2μL，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37℃，反应时间60min；步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、RCA单链产物测序、荧光定量RCA扩增或表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。