[发明专利]利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法

摘要

本发明公开了一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，包括以下步骤： 1）宫内膜干细胞的分离培养和扩增；2）体外诱导分化：A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养； C、选择采用诱导培养基I的体系1或者采用诱导培养基Ⅱ的体系2进行诱导培养；D、2-3天半量换液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。

主权项

利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是包括以下步骤：1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养；培养5~7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；2）、体外诱导分化：A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为4.8×105~5.2×105/孔，每孔加1ml的 Chang氏通用培养基；在36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；C、选择以下任意1个体系进行：体系1：待细胞生长密度到达80‑90%时，向各孔中加入5‑氮胞苷混匀，使5‑氮胞苷达到终浓度为9~11μM； 5‑氮胞苷处理细胞22~26小时后，吸弃孔内培养基，用PBS清洗细胞2次；更换成1ml的诱导培养基I；然后置于36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；随后进行下述步骤D；诱导培养基I的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS（胎牛血清）、39~41ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、 19~21ng的EGF（人表皮生长因子）, 加入DEX（地塞米松）使浓度为49~51nM，加入0.008~0.012ml的ITS premix；体系2：待细胞完全贴壁后，吸弃孔内培养基，更换成1ml的诱导培养基II；然后置于5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；随后进行下述步骤D；诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS、19~21ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、9~11ng的 FGF‑4（人成纤维细胞生长因子‑4）、9~11ng的OSM（重组人致瘤素M）、39~41ng的 DEX（地塞米松），加入0.008~0.012ml的ITS premix（胰岛素‑转铁蛋白‑硒复合物）；D、2‑3天半量换液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。